新学期课件主干第一章蛋白质的结构与功能王丽影副本.pptVIP

* * * * * PBL 教学与以往传统教学的不同之处主要有二：一是学习从被动接受型变为主动探求型；二是强调培养学生的交流能力与信息管理能力。具有完成自身终身教育的能力，也能更 好地适应社会对医师的需求。因此，医学院校教学中引入PBL 模式是医学教育发展的必然要求，是培养合格医学人才的必要手段。因此，引进并实施多种形式的PBL 模式是必然的趋势。 * * 基于蛋白质理化性质的分离和纯化方法 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 透析（dialysis） 根据蛋白质分子大小分离 二、蛋白质的沉淀 使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 三、蛋白质电泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 几种重要的蛋白质电泳: 四、蛋白质层析 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 蛋白质分离常用的层析方法 五、超速离心分离 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 六、多肽链的氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 将大的蛋白质分解成较小片断测序 胰蛋白酶法： 胰凝乳蛋白酶法： 溴化氰法： 水解赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽键 水解芳香族氨基酸（苯丙、酪及色氨酸）羧基侧的肽键 水解甲硫氨酸羧基侧的肽键 溴化氰 溴化氰 N端 C端 胰蛋白酶 Lys Arg Phe Tyr Trp Met Met 胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 蛋白质一级结构测定的新方法 组织 细胞 蛋白质、细胞膜 DNA RNA DNA RNA 加入抗目的蛋白的抗体 mRNA – 目的蛋白质-抗体 1.抽提 2、cDNA的合成 mRNA cDNA 3、测定并识读cDNA序列 4、按cDNA序列识读mRNA序列，并根据密码推测蛋白质的氨基酸组成及一级结构 逆转录酶 蛋白质一级结构测定的新方法 七、蛋白质空间结构测定 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。 同源模建：将待研究的序列与已知结构的同源蛋白质序列对齐——补偿氨基酸替补、插入和缺失——通过模建和能量优化计算，产生目标序列三维结构