生物农药生物农药讲稿3－2章节.ppt

三、分子生物学方法在农用抗生素研发中的应用 分子生物学及生物工程技术的进展 使农用抗生素的产生菌通过分子生物学技术确定其生物合成的步骤及参考这些合成步骤的有关酶系统和基因簇 再通过对产生菌合成基因的克隆鉴定与分析，了解农用抗生素生物合成的限速步骤及相关控制基因 用遗传工程的方法改造产生菌，提高农用抗生素的产量。 有许多分子生物学技术应用于农用抗生素素方面的实例，如阿维菌素、吡咯霉素、刺孢素等产生菌，都通过遗传工程方法进行菌种改良，提高了产素能力，达到了增产的目的。 组合生物合成这一利用分子生物学发展起来的新型技术将为农用抗生素研发带来的新的影响。 分子生物学方法在农用抗生素开发中的应用 吡咯杀真菌素（pyrrolinitrin）产生菌的研究 硝吡咯菌素[ 3-氯-4（2’-硝基-3’-氯酚）]-吡咯是一种广谱抗真菌的抗生素，由色氨酸经生物合成而产生。 最早由Arima 等人从假单孢菌(Pseudomonas Pyrrocinia)中分离得到。在后续的研究中，又从其他假单孢菌和Burkholderia菌中分离到了硝吡咯菌素，并发现它对植物致病真菌有防治作用。另外还发现成团江菌（Enterobacter agglomerans）、橙色粘球菌（Myxococcus fulvus ） 、窄小珊瑚球菌（Corallococus exiguus）、 锈色孢囊杆菌（Cystobacter ferrugineus ）和沙雷氏菌（Serratia sp）等均能产生硝吡咯菌素。 硝吡咯菌素可以抑制真菌呼吸系统的电子传递及阻断氧化磷酸化作用，也有报道称硝吡咯菌素可引起脂蛋白膜的损坏。 硝吡咯菌素（pyrrolinitrin）产生菌的研究 Hill等人从土壤中分离到一株能产生硝吡咯菌素的荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorelces)BL915 分离到在硝吡咯菌素合成中起作用的相关基因。 发现了含有合成硝吡咯菌素所需的四个基因簇，一段6.2kb的DNA。 四个基因中的任何一个缺失即导致硝吡咯菌素的合成受阻。 把这四个基因簇转入大肠杆菌中，可使大肠杆菌产生硝吡咯菌素，从而证明了正是这四个基因编码着硝吡咯菌素生物合成途径所需的酶。 构建了多种不同基因修饰菌株，其中有些菌株的产素能力提高了数倍，尤其是NoA 402216菌株比原来的CGA267356在硝吡咯菌素产素能力上提高了9倍之多。 阿维菌素的研究 阿维菌素是一种典型的次级代谢产物，生物合成复杂。 合成基因的不断分离和测序，现在对每一步合成途径的基因及其所编码的酶都有所了解，这使得人们可利用基因工程技术来构建工程菌，增加有效组分的产出和新型的阿维菌素。 阿维菌素是一组由十六元环内酯 与一个二糖（齐墩果糖）所生成 的苷。在十六元环内酯周围还有 一个含2个六元环的螺缩酮系及六 氢苯并呋喃环系。根据C-5位上取 代基的不同分为“A”，“B”组分； C22和C23之间单双键的差异分为 “1”，“2”组分；C25上的取代基不 同分为“a”，“b”组分。 阿维菌素的合成基因: 阿维菌素产生菌S.avermitilis属于革兰氏阳性丝状菌,它的染色体为线形,约8.7Mbp。因为其在生物合成中具有复杂的次级代谢方式而引起人们广泛的兴趣。 Omura和Ikeda等人对S.avermitilis 99%的基因进行分析，发现了25种次级代谢的基因簇。全部82.0kb的序列被克隆和测序, 他们推测在这个区域基因的组织形式.这82.0kb的序列包括18个开放阅读框架(ORF)。 中心区4个阅读框架为聚酮酶合成酶基因 其中分两组，aveA1-aveA2和aveA3-aveA4,它们负责合成阿维菌素的聚酮部分。这些成簇的聚酮合成酶基因编码12个同源活性组件（PKSAVES），每一个都催化新一轮聚恿链的延伸。AVES1（6,8a-闭联-6,8a-脱氧-5-酮阿维菌素糖苷合成酶；414kDa）包含两个组件负责聚酮链的延伸。AVES2 (666kDa)包含3个组件使之延伸到C13，AVES3（575kDa)包含4个组件使聚酮链延伸到C7，AVES4（510kDa)包含剩余的3个组件完成聚酮链的合成，比其他的抗生素如erythromycin,pikromycin等的PKS基因复杂得多。这四个酶具有55个活性位点构成了目前为止最为复杂的多酶体系。所有的组件都包括?-酮脂酰-ACP合成酶、酰基转移酶和酰基转运蛋白（ACP）活性区域。 两套PKS基因之间的2个开放阅读框架: aveC和aveE,分别与aveA2和aveA3相连,aveC和aveA2的翻译相偶联。虽然aveC的突变导致只产生组分“2”，C22-C23为羟基， aveC基因的氨基酸