分子生物学研究方法-9.ppt

分子生物学研究方法 ;一、 重组DNA技术发展史上的重大事件;三大技术支持 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了限制性核酸内切酶。 1972-1973? H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977? F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。 ;1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠； 1983?获得第一例转基因植物。 1994第一批基因工程西红柿在美国上市。 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 2003年人类基因组计划完成，中国1%， ;基因工程中常见的名词:遗传工程--genetic engineering 基因操作--gone manipulation 基因克隆--gone cloning 重组DNA技术--recombinant DNA technology 分子克隆--molecular cloning。;基因工程的主要内容或步骤:;1． 核酸的凝胶电泳;;; 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此???，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 ; 核酸杂交技术从Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。 60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。; 70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶、载体系统的发展和应用。 固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18～100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因，大大提高了杂交水平和可信度。;核酸杂交反应首先经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，然后通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到滤膜上的。 常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。 ;?? 将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。核酸杂交也称印迹杂交。 ; 核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组织病理学的研究、生物分类方面。; 核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成出现稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 分子杂交可在DNA与DNA（Southern blot）、RNA与RNA(In situ)或RNA与DNA(Northern blot)的二条单链之间进行。; 由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。 ;是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程。将核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上。是核酸杂交过程中的主要步骤之一。;;探针标记;;杂交的方法： ; 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。;;点杂交（Dot blot）;; Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析、特定基因组的分析及PCR产物分析等方面有重要价值。;基本方法;将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法。 DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。 Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合以及保持其单链状态。; 组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，