细胞的冻存、复苏和运输.pdfVIP

◆Animal Cell Engineering ◆ Chapter 4 Animal Cell Culture ◆Biology of cells in culture ◆Fluid for cell culture ◆Standard cell culture techniques ◆Establishing a cell line or cell strain ◆Cell freezing and recovery Section 5：细胞的冻存、复苏和运输 1、细胞冻存 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工 作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减 少入力、经费，减少污染，减少细胞生物 学特性变化。 2、细胞复苏 在体外培养工作中，常要将体外培 养物进行冷冻保存，在需要时再复温 融解进行体外培养（复苏）。 细胞的冻存与复苏 要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几 个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂， 冷冻保存温度。 冷冻速率：慢冻 （？） 复苏速率：快融 （？） 冷冻保护剂：5－15％甘油或二甲基 亚砜（DMSO） （？） 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮） 为什么要加冷冻保护剂 对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂 的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存 物。 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一 些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二 醇、乙酰胺、甲醇等，。 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分 子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二 醇、羟乙基淀粉等。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细 胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞 损伤甚至死亡。 甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可 使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结 晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶 的重结晶。融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-5－0度 冻存和复苏的原则：慢冻快融 冻存方法 1）预先配制冻存液：含10%－20 ％血清的培养基＋ 10% DMSO或甘油 2 ）取对数生长期细胞，经胰酶消化（或离心）后，加 入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液 6 6 （1×10 ～5 ×10 细胞/ml) 3 ）加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名 称和冷冻日期。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 慢冻程序 标准程序： 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min （4 ℃冰箱存放30min ） 当温度达-25 ℃以下时，5～10 ℃/min （-20℃冰箱存放1.5-2h ） 当温度达-80℃时，可迅速放入液氮中 （-70℃冰箱存放4-12h ） 转入液氮罐，注意登记！ 简易程序： 将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳 将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2 ℃的速度，在40分钟 内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 复苏方法 （l ）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴 中，使其融化（1分钟左右）。 （2 ）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 （3 ）低速（800－1000rpm）离心10分钟。 （4 ）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。每日 观察细胞生长情况，若死细胞较多，次日应换液。 3、细胞的运输 ◆ 贴身