血清microRNA在宫颈癌诊断中的诊断价值.docVIP

精品论文 参考文献 血清microRNA在宫颈癌诊断中的诊断价值 贾伟利 郭光辉 刘雄伟 　　（深圳市龙岗中心医院检验科 广东深圳 518000） 　　【摘要】目的：在宫颈癌患者血清中筛选差异表达的microRNA（miRNA）,寻找早期诊断宫颈癌的血清标志物。方法：采集50例宫颈癌患者和30例健康妇女血清标本，提取血清中RNA，利用Microarray基因芯片方法在病例组20例和对照组20例混合血清样本中筛选差异表达的miRNA，采用实时荧光定量PCR对差异表达的miRNA验证，并绘制ROC曲线分析这些miRNA在诊断宫颈癌的价值。结果：Microarray芯片检测结果显示在宫颈癌患者血清中存在miRNA差异表达，其中表达上调的5个，分别为miR-21、miR-25、miR-205、miR-486-5p和miR -148a，表达下调的2个，分别为miR-143和miR-372。实时荧光定量PCR验证筛选出的miRNA，与芯片筛选的结果一致。选取差异表达最显著的3个miRNA（miR-25、miR-205、miR-486-5p）作为诊断宫颈癌的候选标志物，其ROC曲线下面积分别为0.972、0.949和0.944，通过最佳临界值分析，其诊断宫颈癌的灵敏度和特异性分别为92%、93.3%，90%、96.7%和90.0%、90.0%。结论：宫颈癌患者血清中存在miRNA表达异常，miRNA是诊断宫颈癌的潜在的血清标志物。 　　【中图分类号】R730.4 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）11-0078-02 　　宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一，病死率居发展中国家女性肿瘤之首位。全球每年大约有50万新发宫颈癌病例，其中80%以上的病例发生在发展中国家[1]，我国每年新发病例约3万，约占世界宫颈癌新发病例的28.8%，并呈年轻化及上升趋势[2]。因此急需选取一种比较适合发展中国家的实验室筛查方法，以早期诊断宫颈癌。microRNA（miRNA）是一组长约22个核苷酸的非编码小分子RNA，通过转录后水平调控细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动[3，4]。近几年的研究发现 microRNA 表达具有明显的组织细胞特异性，且与肿瘤的发生和发展有着密切联系。最近在外周血中也检测到miRNA的存在，且发现循环miRNA的表达与肿瘤也有一定的相关性，这提示miRNA可作为一种新型的血清肿瘤标志物。因此本文通过miRNA芯片筛选出宫颈癌特异的miRNA，再经过荧光定量PCR（RT-qPCR)验证已筛选出的特异miRNA，最后通过荧光定量PCR检测血清中这些miRNA，利用受试者工作特征曲线(ROC)来评估候选miRNA在宫颈癌诊断中的价值。 　　1.资料与方法 　　1.1 临床资料 　　2012年6月至2015年1月在深圳龙岗中心医院治疗的50例宫颈癌患者为研究对象（病例组），病理诊断均为鳞状细胞癌，年龄26～68岁，并选择同期体检健康妇女30例作为正常对照组，年龄27～69岁。两组年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。 　　1.2 标本收集 　　所有病例组血液标本均在治疗前清晨空腹采集，对照组在清晨体检时一并留取，2000r/min离心10min后取上清，-70℃保存备用。 　　1.3 Microarray芯片筛选 　　分别将20例病例组血清混合与20例对照组血清标本混合，提取总RNA，通过Microarray芯片进行miRNA表达检测，利用U6snRNA进行校正比较两组miRNA的差异表达，筛选出差异表达ge;2倍的miRNA，进一步验证。 　　1.4 实时荧光定量PCR 　　1.4.1 miRNA使用天根生化科技(北京)有限公司的miRcute miRNA提取分离试剂盒(离心柱型)，按试剂说明书 A 方案进行操作。 　　1.4.2 miRNA反转录反应 参照 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA，-70℃保存。 　　1.4.3实时荧光定量PCR 检测 使用7300型序列检测系统(ABI公司产品)，每个反应孔为20mu;L反应体系，包括1mu;L逆转录产物、0.33mu;L miRNA Taqman引物、18.67mu;L体系混合物Ⅱ。反应体系在PCR仪上温度设定为:95℃15 s，60℃1min，进行 40个循环。 　　1.5 数据分析 　　以 miR-let7 作为内参，miR-16建立标准曲线，参照Chen 等[5]描述绝对表达量计算方法，计算出差异表达 miRNA的绝对含量。Ct值为反应过程中实时荧光强度到达设定的阈值时所经过的扩增循环数，此时扩增呈对数增长，C