高效液相色谱法分离大豆蛋白肽.pdfVIP

第22卷第2期 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 Vol.22,No.2 2006年3月 Journal of Qiqihar University March,2006 高效液相色谱法分离大豆蛋白肽* 卢 鹤 郑永杰 齐齐哈尔大学化学与化学工程学院 齐齐哈尔 161006 摘 要 本文采用Alcalase碱性内切蛋白酶为工具酶水解大豆蛋白 通过实验选择最佳水解条件 采用超滤以及 凝胶过滤色谱法(Sephadex G―15)分离出分子量1000以下的小肽并收集,将收集到的不同功能性目标肽段在最佳色 谱条件下进行分离 关 键 词 高效液相色谱 大豆肽 超滤 凝胶过滤 + 中图分类号 O657.72 文献标识码 A 文章编号 1007-984X(2006)02-0001-03 本文研究的大豆肽是指大豆蛋白经过水解 分离 精制等过程而获得的通常由3 6个氨基酸组成 的 相对分子质量低于 1000的肽类混合物 肽类的相对分子质量主要分布在300700范围内 其中 还含有少量的游离氨基酸 糖类 无机盐等成分 近些年来具有重要生物活性的新肽不断被发现 原有的肽类也不断被发现具有新的生物功能 这 些肽类在各种生理活动中都起着重要作用 高效液相色谱(HPLC)已广泛用来分离 分析和制备多肽 蛋白等生物样品[1-2] 尤其是反相高效液相色谱已成为许多研究肽类的实验室的主要分离分析手段 本文采用反相高效液相色谱 RP-HPLC 考察了梯度条件和TFA用量对大豆肽样品分离的影响 建 立了大豆肽的RP-HPLC的分离分析方法 为下一步液相色谱质谱联用测序提供了实验的依据 1 实验部分 1.1仪器与试剂 仪器 高效液相色谱系统 大连依利特分析仪器有限公司 包括:P230高压恒流泵 UV230紫外检 测器 EChrom98色谱工作站 ODS HYPERSIL C185um,250mm4.6mmHIS―H水浴振荡器 PHS-25 型酸度计 80-2型离心沉淀机 BS110S型电子天平 超滤装置 BSI―100自动部分收集器 722―光 栅分光光度计 1000L移液器 GM―0.33隔膜真空泵 试剂与样品 大豆分离蛋白(蛋白含量﹥95%)Alcalase碱性蛋白酶 pharmacia公司 葡聚糖凝 胶 G15(上海亚东核级树脂有限公司)NaOH分析纯 HCL分析纯 磷酸二氢钠 分析纯 磷 酸氢二钠 分析纯 色谱纯乙腈 天津科密欧科技有限公司 三氟乙酸(TFA)色谱纯 1.2实验步骤 1.2.1酶水解实验 1.2.1.1酶水解反应 配制底物浓度为6%W/V的大豆蛋白分离溶液 80预处理 10min后 将温度调至 55 置 于恒温水浴振荡器中恒温 用1mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值至8.5然后以加酶用量为50mL/kg 加入Alcalase碱性内切蛋白酶 置于恒温水浴振荡器中振荡水解大豆分离蛋白 在反应过程中及时加 入1mol/L的氢氧化钠溶液以维持大豆分离蛋白溶液的pH在8.50.1的范围内 反应2.5h后将酶解液 迅速升温至90 恒温 10min以钝化蛋白酶 冷却后用4000r/min的离心机离心分离 1.2.1.2 超滤分离 收稿日期 2005-10-15 基金项目 黑龙江省自然科学基金项目 B0314 作者简介 卢鹤 女 1982年生 分析化学2004级研究生 2 齐 齐 哈 尔 大 学 学 报 年 将水解产物 1000mL分别通过三种超滤膜进行分离 分别获得分子量在200002000010000 1000060006000四个肽段 1.2.1.3凝胶过滤分离 将6000以下的肽通过SepHadex G15进行分离收集分子量1000以下的肽段 1.2.2高效液相色谱条件实验 将分子量在 1000以下的小肽用0.1%TFA水溶液溶解后 取一定浓度的小肽样品溶液进样至已用 流动相A液 水+0.1%TFA(V/V/%)平衡过的RP-HPLC色谱上 然后