生物技术在植物病理学中的应用PPT.pptVIP

单克隆抗体技术-动物免疫 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。　　　　　 　 初次免疫　 Ag　1-50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射 　　　　　　　　│　　　　　(一般0.8-1ml　0.2ml／点) 　　　　　　　　↓3周后 　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip 　　　　　　　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml) 　　　　　　　　↓3周后 　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip 　　　　　　　　│ (5-7天后采血测其效价，检测免疫效果) 　　　　　　　　↓2-3周后 　　　　　　加强免疫，剂量50-500μg为宜，ip或iv 　　　　　　　　↓3天后 　　　　　　　取脾细胞融合 　　①将可溶性抗原颗粒化或固相化，增强了抗原的免疫原性，同时降低抗原的使用量。②直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平。 单克隆抗体技术-细胞融合 将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，用不完全培养液洗1次，1200rpm离心8分钟。 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。 在室温下融合: 30秒内加入预热的1ml45％PEG4000,含5％DMSO，边加边搅拌。 作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。 加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。 离心，800rpm，6分钟。 弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。 根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。 单克隆抗体技术-选择杂交瘤 HAT 选择培养液：次黄嘌呤（H）核苷酸前体，使cell通过替代途径合成DNA ；氨基蝶呤（A）叶酸拮抗物，阻断cell合成DNA的主要途径 ；胸腺嘧啶核苷（T）使cell通过替代途径合成DNA 在HAT培养液中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。 一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。 单克隆抗体技术-杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。 通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。 采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。 经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。 单克隆抗体技术-抗体的检测 一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。 检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。 　　常用的方法有: ELISA（酶联免疫吸附测定）用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。 RIA（ 放射免疫性鉴定）用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。 FACS(荧光激活细胞分类仪) 用于检查细胞表面抗原的McAb检测。 IFA（免疫荧光分析）用于细胞和病毒McAb的检测。 可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。 酶联免疫吸附测定-ELISA Indirect-ELISA操作过程 包被抗原(Ag) 每孔100微升，每样品两次重复，以碳酸缓冲液为空白对照，设正负对照。37℃下包被2小时，然后用PH 7.4 PBST缓冲液冲洗3~5次，注意避免各孔互混，每次冲洗至少5分钟。 抗原稀释液为pH9.6碳酸缓冲液：1L蒸馏水中加Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，NaN3 0.2g。 pH7.4 PBST洗涤缓冲液：NaCl 8g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KCl 0.2g，NaN3 0.2g，distilled water 1L，Tween 20 0.5ml，NaN3 0.2g。 Indirect-ELISA操作过程 加抗血清