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白血病微小残留病 Initial Therapy of AML Diagnosis 定义 Minimal residual disease(MRD)---微小残留病 指白血病诱导化疗完全缓解后或者骨髓移植后残留在体内少 量白血病细胞的状态,可能是导致白血病复发的根源 白血病细胞负荷 初次诊断 --- 1012 形态学缓解 --- 1010以下 分子学缓解 --- 约106-107 检测MRD的意义 根据细胞负荷调整缓解后化疗方案 更早发现药物耐药性 更早预测白血病复发 评价骨髓移植净化效果 为实验研究提供依据 MRD主要检测方法 一、染色体核型分析 二、荧光原位杂交--- FISH 三、流式细胞仪---FCM 四、聚合酶链反应技术---PCR 五、其他：细胞培养技术，免疫荧光等 染色体核型分析 常用染色体显带技术检测出染色体畸变,但其成功率依赖于标本中分裂象细胞的数量多少，从而使得检测结果各不相同，且敏感度较低，约1：20 FISH fluorescence in situ hybridization 用荧光素标记染色体特异性探针和特异性基因的DNA探针，通过与间期细胞核DNA或中期染色体DNA原位杂交识别染色体数目和结构的异常，可以进行定性、定位和相对定量分析 。 优点：FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核. Interphase and metaphase FISH demonstrating a variant of the Philadelphia chromosome. The genes that are rearranged are: BCR(green on chromosome 22)/ABL (orange on chromosome 9)The Ph’ translocation appears as dual fusion (yellow) signals. Karyotype showing the Philadelphia chromosome.46,XX,t(9;22)(q34.1;q11.2) Figure 5: Detection of PML-RARa gene fusion by interphase FISH:Left: S-FISH (one wild type PML, one wild type RARa, and one yellow fusion signal);Right: D-FISH (one wild type PML, one wild type RARa, and two yellow fusion signals). RT-PCR 逆转录聚合酶链反应技术 利用染色体易位形成的肿瘤特异融合基因或基因重排作为分子靶，在引物作用下，通过聚合酶链反应，短时间内将特异性序列扩增百万倍，然后用凝胶电泳显示出来 优点：特异性、灵敏度大大提高（可达10-5—10-6） QRT-PCR---荧光实时定量PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具 目前real-time Q-PCR实验成本比较高，且各实验室标准不一，从而也限制了其广泛的应用。 流式细胞Flow Cytometry 测量群体中单个细胞经适当染色后其成分所发出的散射光和荧光，经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞经过焦点时，发出一束散射光/或荧光,经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器,光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，以调出显示和进行分析。 造血细胞在不同分化阶段有不同的分化抗原（CD）表达。恶性肿瘤细胞可表现为抗原表达紊乱的现象如抗原的出现或消失与细胞分化水平的不同步，出现与正常细胞不同的抗原组合，即为白血病相关免疫表型 多参数 如四色染色技术，可用于AML\ALL\CML 快速、准确、重复性好，可行定量及动态观察，敏感度可达10-4以上 MRD 检测在AML中的应用 评价AML治疗预后因素 诱导治疗后白血病细胞负荷减少程度及达到CR时间被认为是提示预后的独立因素 MRD检测目的：预示分子学