细胞污染后的挽救方法.docxVIP

细胞污染后的挽救方法以自建细胞系(laryngeal squamous carcinoma-1, LSC-1)第12代的某一被细菌污染的细胞株采取救治,比较效果并分析细胞生物学特性。实验方法1)抗生素法:细菌培养:用无抗生素完全培养液培养细胞3 d,收集上清离心后将沉淀物接种于血琼脂培养基, 35e培养。所采用的抗生素包括临床常用的15种抗生素，抗生素最适抑菌浓度筛选:根据细菌药敏实验结果选出敏感抗生素,每种抗生素从最低抑菌浓度MIC到最高耐药浓度分别配制6个浓度梯度。将LSC-1细胞按1*104/孔种96孔板,细胞贴壁后加入含敏感抗生素的完全培养液,24 h后换无抗生素培养液培养1 d,如此重复3次,连续7 d。2)抗生素联合巨噬细胞吞噬法:将上述抗生素处理过的细胞再用小鼠的巨噬细胞处理。巨噬细胞的制备:将灭菌的玻璃粉与0. 9%氯化钠注射液混和注入小鼠腹腔, 3 d后脱颈处死动物,无菌操作取小鼠腹腔液,离心收集巨噬细胞,与LSC-1细胞混合培养, 3 d后换液,弃去巨噬细胞。间隔一周后再用巨噬细胞共培养一次。3)裸鼠体内接种法:将LSC-1细胞按1*106个/mL接种裸鼠腋下皮下,连续观察,当肿物长至约1cm3后,脱颈处死动物,无菌操作取出肿物,采取组织块法做组织细胞培养。效果鉴定免疫组织化学鉴定:将上述3种方法处理的LSC-1细胞种植在直径为15 mm的无菌圆形盖玻片上,贴壁后做角蛋白AE1 /AE3免疫组化染色、HE染色细胞周期鉴定:采用流式细胞仪测量碘化丙啶标记细胞的荧光强度,分析DNA含量。测试3种方法处理的LSC-1细胞周期,并与该细胞建系初期的第3代细胞状况做比对。抗生素撤离观察:用无抗生素的完全培养基培养3种方法处理的细胞,连续观察3周,取细胞上清做细菌培养。细胞系的维持、冻存与复苏:将无抗生素培养3周的细胞按常规方法冻存,并于1个月后复苏,观察细胞生长状态。结果自建人喉癌细胞系LSC-1传至第12代以后,细胞生长速度变慢,已贴壁细胞变圆、漂起、死亡,细胞间隙出现可运动的微小生物,但培养液依然清亮不浑浊,收取上清液离心,将沉淀物行常规血琼脂培养, 24 h结果为无菌生长,培养5~7 d后开始出现灰白色细小菌落,光滑湿润,有透明溶血环,全自动细菌鉴定仪生化鉴定条检测为嗜麦芽寡养食单胞菌,该菌为非发酵革兰阴性杆菌。细菌药敏结果:在15种抗生素中,该菌仅对头孢他啶、哌啦西林、头孢哌酮/舒巴坦3种药物敏感，其余均耐药。3.1 抗生素法除菌效果经筛选, LSC-1细胞可耐受的抗生素最佳抑菌浓度分别为:哌啦西林64 mg /L、头孢他啶2 mg /L、头孢哌酮/舒巴坦32 mg /L。LSC-1细胞在哌啦西林和头孢他啶最佳抑菌浓度中分别传代一次,在头孢哌酮/舒巴坦中传代3次,并每种细胞各冻存3株。复苏情况:哌啦西林3株均未贴壁,头孢他啶两株复苏后贴壁,但生长一周后均出现细菌,细胞死亡;另一株第二次冻存,再次复苏后生长良好,但抗生素撤离后出现细菌,经鉴定仍为嗜麦芽寡养食单胞菌。头孢哌酮/舒巴坦3株复苏后均能存活,但生长缓慢,一周传代一次,仍有少量细菌,抗生素撤离后重又出现细菌污染。在3种抗生素中,头孢哌酮/舒巴坦抗菌作用和细胞生长状态最好,头孢他啶对细胞损伤较大,细胞表面粗糙,状态较差。3.2 抗生素联合巨噬细胞吞噬法除菌效果比较头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞先后使用和二者交替使用的除菌效果,并观察细胞冻存复苏后的传代次数,具体方法为:头孢哌酮/舒巴坦32 mg /L培养1次、2次、4次后,再分别与巨噬细胞共培养2次,各冻存1株;头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞交替培养3次,冻存1株。复苏后细胞状态:头孢哌酮/舒巴坦和巨噬细胞依次使用者中,抗生素使用次数较多的细胞传代次数较多(5代);二者交替使用的细胞状态更好于前3株细胞,且传代次数也最多(6代)。然而所有细胞最终因状态不佳或污染重现而死亡。3.3 裸鼠体内接种法除菌效果肿瘤细胞接种裸鼠体内40 d后开始出现肿块, 60d长至1 cm3左右。处死动物取出肿物,瘤体质量0. 39 g,体积为0. 8 cm*0. 6 cm*0. 4 cm。将组织块培养于含三抗的完全培养基, 14 d后改用无抗生素培养,持续培养3周,细胞生长良好。之后自然传代8次,冻存1个月后复苏,细胞仍能贴壁生长。取上清液做细菌培养,结果为无菌生长。3.4 细胞形态及生物学特性抗生素处理及裸鼠接种后的LSC-1细胞形态与LSC-1第三代基本相同,细胞呈多边形,有铺路石感。免疫组织化学细胞角蛋白染色,裸鼠接种后的和抗生素处理的细胞均有AE1 /AE3阳性表达,但前者阳性比例(图1H)与第三代细胞(图1G)接近,后者阳性表达较少。HE染色,接种裸鼠的LSC-1细胞具有高度的异型性:细胞形态及大小不等;核呈多形性:大小、形