动物细胞和肿瘤细胞的培养.pptVIP

第五章　　 正常细胞和肿瘤细胞培养 　;第一节 正常细胞培养;肝细胞的培养;;内皮细胞培养;实验步骤： 1.新鲜脐带无菌剪取长10-15厘米； 2.入口处用线绳结扎，温PBS 液注入脐带的脐静脉中，洗除残血； 3.用从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1％的胶原酶，待末端出现液体后结扎之，消化3-10 分钟； 4.吸出含有内皮细胞的消化液，注入离心管中（可用温PBS 冲洗2-3 次获取尽量多细胞）； 5.离心去上清，加1640 培养液，制成细胞悬液，接种培养，顺利时2-3 天内细胞即可长成单层。 ;巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。 为获取多量巨噬细胞，可于取材3-5天前，向动物腹腔中注射刺激物，如牛血清、矿物油、硫羟乙酸盐肉场等，均能刺激产生大量巨噬细胞；缺点是很多刺激物能激活吞噬细胞并被其吞噬，进行培养以后，刺激物常不能很快被消化掉，残留在细胞内，能干扰细胞代谢。 ;培养方法： 1.实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫经乙酸肉汤1ml ； 2.引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入70％酒精中3-5 秒； 3.置动物于解剖台上，用70％酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10ml Eag1e 液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动； 4.用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内； 5.小心拔出针头，把液体注入离心管中，1000rpm 离心10 分钟后，去上清，加10 ml Eagle 培养基； 6.计数细胞，每只小鼠可产生20 ~ 30×106 细胞，其中90％为巨噬细胞。 ;注意事项： 获的巨噬细胞群中，多混有其它细胞成分，如淋巴细胞、中性细胞、血小板和成纤维细胞等，可利用大多数单核巨噬细胞能易附着的特性，使用附着分离法将其他细胞除去。 在先把细胞群置于玻璃培养容器中数小时后，巨噬细胞能最先附着于玻璃表面，此时再用培养液或PBS 冲洗掉尚未附着的中性粒细胞和激活的T 淋巴细胞等，剩余巨噬细胞纯度可达95％。 可继续延长时间至24 小时，此时大多数巨噬细胞都已附着于瓶壁，而中性粒细胞可变性死亡。继之再从瓶壁上把巨噬细胞分离下来进行培养，便获得纯净巨噬细胞。 ;一、肿瘤细胞体外培养的特点 细胞保持永生性：自我复制 形态学：大小不一 ? 逐渐一致 突变性：不同于正常细胞，失去稳定的控制，高分化变低分化 增殖力更强 接触抑制减弱或消失 成瘤性：移植到动物体内可成瘤 体外肿瘤细胞培养不受体内环境因素影响，避免个体差异性，便于探索各种理化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。;1．形态和性状 (1)形态不规则，细胞界限清晰，核大，核仁数目多，核膜和核仁轮廓清楚。 (2)折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，微丝走行不规则，与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。;2.培养特征 (1)营养要求不高，在无血清或低血清条件下仍能生长。 (2)能自分泌促增殖因子，软琼脂培养单个细胞能形成集落。 (3)生长方向性消失，失去接触抑制，数量增多时可呈多层重叠生长。 (4)细胞饱和密度大，分裂指数高，细胞倍增周期短。 肿瘤细胞失去密度依赖抑制或者接触抑制能力，不需要依附于固定表面，不受密度限制，可持续分裂增殖，形成多层堆积。 ;3．永生性 (1)永生性（immortality）也称不死性，体外培养表现为可无限传代而不死亡，体外培养的肿瘤细胞系、株都具有这种特性。 (2)体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性（包括侵润性）是两种性状，受不同基因调控。 (3)多数恶性肿瘤在体外培养时并不那么容易成功，永生性是在体外培养后获得的。 ;4．侵润性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。; 5．异质性 (1)所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性细胞。 (2)肿瘤的异质性是指同一肿瘤在组织结构和功能性质上是由不同性质的细胞所组成的。 (3)其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分。 ;6．细胞遗传性 体外培养的肿瘤细胞失去了二倍体核型，呈异倍体或多倍体生长。;1.细胞种类：肝癌HepG2细胞株； 2.培养的天数：培养3天； 3.放大倍速：倒置显微镜，×20倍； 4.培养基种类：DMEM（高糖型）+10%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈不规则多边形贴壁生长 ;细胞种类：淋巴瘤细胞U937 培养的天数：2d； 放大倍速：倒置显微镜 X10； 培养基种类：1640+10%胎牛血清；