动物生理学实验实验三、小鼠骨髓细胞微核试验.doc

实验二、小鼠骨髓细胞微核试验 一、目的 主要通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞(PCE)的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。 二、原理 微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的 1／20—1／5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺缍丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。 微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出．而仍保留微核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中的微核。 三、器材与试剂 器材 手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃染色缸、2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。 (二)试剂 甲醇(分析纯)、甘油(分析纯)、小牛血清、生理盐水。 1．吉姆萨(Giemsa)贮备液 取Giemsa染料1g，甘油66ml，甲醇60ml, 先将染料置于研钵内，加入小量甘油混合研细，再分次倾人剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置60℃水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该贮备液存放的时间越长，染色效果越好。临用时用pH6.4的磷酸盐缓冲液配制为10%的应用液。 2．磷酸盐缓冲液 (1)甲液——1／15mol／L磷酸氢二钠(Na2HP04) 称取无水Na2HPO4 9.47g溶于l000ml蒸馏水；含2、7和12份结晶水时，则分别称取11.87g、 17.87g和23.88g。 (2)乙液——1／15mol／L磷酸二氢钾(KH2PO4)溶于1000ml蒸馏水。称取KH2PO4 9.08g 为配制吉姆萨染液和吖啶橙染液，需配制3种磷酸盐缓冲液：①pH6.24磷酸缓冲液，取甲液20ml和乙液80ml混和即可；②pH6.47磷酸缓冲液，取甲液30ml和乙液70ml混和即可；③pH6.8磷酸缓冲液，取甲液49.5ml和乙液50.5ml混和即可。 各种pH的磷酸缓冲液配成后，可用pH计加以校准，调节至所需的pH。 3．吖啶橙染液 (1)吖啶橙染液 以0.1％吖啶橙水溶液作为贮备液。称取吖啶橙0.1g溶于100ml蒸馏水中。置褐色瓶内，在4下可保存数周。 (2)吖啶橙工作液 以0，24mmol／L吖啶橙磷酸缓冲液作为工作液，临用时配制。取2份0.1％吖啶橙贮备液，30份1／15mol／L pH6.8磷酸缓冲液混匀即得。 四、操作步骤 1．动物 一般选用7-12周龄、体重20-30g的小鼠，也可选用体重150-200g的大鼠。每个剂量组至少用两种性别的动物各5只。若需多次采样，则每组的动物数需增加，每个采样时间至少有8只动物。 2．剂量及分组 根据受试物的理化性质(尤其是溶解度、水溶性或脂溶性)，确定溶剂。一般采用水或食用植物油，不溶者可用淀粉制成混悬液。 一般在受试物的1/2～1／30 LD50范围内选择3-4个剂量组。也可采用急性毒性试验中出现中毒而不致死的剂量作为染毒最高剂量组，以畜禽的可能摄入量作为最低剂量组，中间插入1～2个剂量组。同时设对照组，即空白对照、溶剂对照和阳性对照。阳性对照组用环磷酰胺生理盐水溶液一次腹腔注射30-50mg／kg，或以环磷酰胺水溶液80～120mg／kg，经口染毒两次，间隔24h。 3．染毒途径 根据受试物的性质及与畜禽接触方式不同，可分别选用灌 4．染毒方法 一般采用2次染毒方法，两次间间隔24h。 5．制片 (1)骨髓细胞液的制备 在第二次给予受试物6h后小鼠脱颈椎处死。取下小鼠两侧股骨，剔去肌肉，用滤纸或纱布擦去血污和肌肉，剪去股骨两端。用配有6号针头lml注射器吸取小牛血清约0.05ml冲洗骨髓腔数次，将冲洗物滴在载玻片上。0.5-1ml, 将除去血污的股骨放入瓶内，用止血钳将其夹碎，再用点滴管吸取其液体部分于小离心管中，4000rpm离心2分钟, 弃去部分上清，留约0.3－0.5ml液体，混匀后涂片。 (2)涂片 将玻片上的冲洗物调匀后，推片若干张。迅速干燥，可在酒精灯上短时烘烤。 (3)固定 将干燥的涂片置甲醇液中固定5～10min，取出晾干。当日不染色的涂片亦应固定后保存。 (4)染色