《质粒DNA的提取》课件VIP

实验一 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 一、质 粒 概 述 基因工程载体分类： 质粒载体 噬菌体载体（容量大） 病毒载体（导入效率高、低毒） 概念： 质粒（plasmid）是存在于细菌染色体外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。 实验目的 掌握质粒抽提的目的 了解质粒抽提原理 熟悉质粒抽提方法 一、实验原理 理论基础： 宿主染色体DNA与质粒DNA的区别 实验操作原理：三个基本步骤 细菌培养 裂解细菌以及质粒的初步分离 质粒DNA的纯化 理论基础 细菌质粒是一类双链闭环的小分子DNA，独立于细菌染色体之外，能够进行自我复制。质粒作为载体广泛应用于目的基因的克隆、测序、表达等工作。 宿主染色体DNA与质粒DNA主要区别： 宿主染色体DNA 质粒DNA 分子大小 分子大 分子小 抽提结果 断裂成为线状 共价闭合环状结构 实验操作原理 分离质粒DNA包括3个基本步骤： ⑴ 培养细菌 在含有相应抗性的液体培养基中培养已转染质粒的细菌，使细菌快速增殖的同时质粒DNA得到大量扩增。目前常用的质粒均具有很高的拷贝数。 37oC 振荡过夜 ⑵ 裂解细菌以及质粒的初步分离 最普遍采用的方法是SDS-碱裂解法。将细菌培养物离心并以缓冲液悬浮，加入SDS溶液破坏细胞，再加入钾离子沉淀SDS与大分子DNA并离心去除，小分子的质粒DNA即处于上清液中。 细菌沉淀 SDS-碱 变性质粒DNA 变性染色体DNA、蛋白质 酸、钾 上清复性的质粒DNA 沉淀的变性染色体DNA、蛋白质 进一步纯化 （3）获取高纯度质粒DNA的方法 密度梯度离心 CsCl密度梯度离心是最经典的方法，可获得高纯度质粒DNA，但繁琐费时。 离子交换层析 DEAE离子交换层析利用DNA、RNA及蛋白质与DEAE基团间电荷作用的强弱差别分离， 吸附层析法 玻璃珠吸附层析利用DNA在高盐浓度条件下与细小玻璃珠的特异性吸附作用进行分离。 纯化的质粒DNA有三种存在形式 共价闭环DNA，即超螺旋形式； 开环DNA,即质粒DNA的两条链中有一条发 生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力，形成松弛的环状分子； 线状DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。 质粒电泳示意图 Best better not good 点样孔 开环 线状 双螺旋 吸附层析法纯化质粒DNA 质粒的快速抽提 溶液I含有RNA酶，水解RNA，并为低渗溶液，但由于细菌有细胞壁，因此不会破裂。 溶液Ⅱ中的SDS具有强烈的破细胞作用，使基因组DNA释放 溶液Ⅲ使基因组DNA与SDS及钾离子结合形成沉淀。 将含有质粒的上清加入到层析柱中，利用玻璃珠吸附层析分离质粒。 1. 取 1-5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，9000 rpm ，30s，尽量吸除上清。 2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250 μl 溶液 P1。使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 3. 向离心管中加入 250 μl 溶液 P2，温和地上下翻转 6－8 次使菌体充分裂解。 注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA ，造成提取的质粒中混有基因组 DNA 片断。 4. 向离心管中加入 350 μl 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6–8 次，充分混匀，13,000 rpm ，10 分钟。 5. 将上清液转移到吸附柱 AC 中 ，13,000 rpm ，1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 放回收集管中。 6. 向吸附柱 中加入 700 μl 漂洗液 WB，12,000 rpm ，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 放回收集管中。（洗去高盐） 三、质粒抽提操作步骤 7. 向吸附柱 中加入 500 μl 漂洗液 WB，12,000 rpm ，30s，倒掉收集管中的废液。 8. 将吸附柱 放入收集管中, 13,000 ，离心 2 分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、 PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱 CP3 开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 9. 将吸附柱 CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 50μl 洗脱H2O，室温放置 2 分钟，12,000 ，1 分钟将质粒溶液收集到离心管中。 10. 重复步骤 9。 注意：洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用去离子水做洗脱液，并保证其 pH值在 7