生化实验五酶联免疫吸附法测定抗血清效价.pptVIP

实验五酶联免疫吸附法测定抗血清效价 一、目的 二、原理 间接法的原理 先将抗原吸附于载体表面，洗去未吸附的部分， 然后加入待测血清，使其中的特异抗体蛋白（第一抗体）与抗原结合物，再洗去未结合的部分， 加入酶抗体的抗体（第二抗体，即第一抗体的抗体），与抗原-抗体复合物相结合，产生酶标记的免疫复合物，洗去未结合的酶标记物， 加入底物，在酶的催化下产生有色物质，通过比色测定光密度值，即可算出抗血清中抗体的存在量。 抗血清效价 制备的免疫血清，必需进行效价的测定。 抗血清的效价：它与一定量抗原作用时出现肉眼可见颜色反应的最大稀释度。 分光光度计测定法：应用一系列连续稀释的抗血清，与固定的抗原反应，分析计算出现颜色的最大稀释度（吸光度差值需大于0.05）。 三、操作步骤 1. 包被：96孔板包被适量BSA（100 ul），4℃过夜。 2. 洗涤：漂洗3次，每次300 ul，每次3 min。 3. 一抗孵育：加入稀释的一抗（100 ul），37℃孵育1 hr。 4. 洗涤：漂洗3次，每次300 ul，每次3 min。 5. 二抗孵育：加入稀释的酶标二抗（100 ul），37℃孵育30 min。 6.洗涤：漂洗3次，每次300 ul，每次3 min。 7.显色反应：加入显色液200 ul，避光显色15 min。 8.终止：加入2 N (N:当量浓度)H2SO4 50 ul，终止反应。 9.测定：酶标仪读数（OD490读数）。 四、实验报告要求 1. 原理 （铅笔绘图） 2. 操作 3. 结果 4. 结果说明（判断本实验中抗体的效价？） * * 学习和掌握ELISA的基本原理 间接ELISA 重点掌握 测定抗体效价的方法 ELISA基本原理基于三个特点： 1） 抗原或抗体能结合到某些固体载体的表面仍保持其免疫活性； 2） 抗原或抗体与某些酶结合形成的结合物仍保持免疫活性和酶的活性； 3） 结合在免疫复合物上的酶当遇到相应的底物时，可以催化底物发生水解、氧化或还原等反应，且产物是有色的物质。颜色反应的深浅与相应的抗原或抗体量成正比，因此可通过测定颜色反应的深浅程度来定量抗体或抗原的含量。 抗原 酶标抗体 底物 直 接 法 原 理 首先将抗原或抗体吸附在一个合适的固体载体 表面上，洗涤 然后以酶标记的抗原或抗体与被吸附 的相应抗体或抗原结合形成有酶标记 的抗原-抗体复合物，洗涤 当加入适合底物时，复合物上的酶即 催化底物发生反应，产生带色的产物。 因在一定条件下，酶降解底物的量与 呈现的色泽成正比关系，因此通过分 光光度计测定色度，即可计算出参与 反应的抗原或抗体的含量。 抗原 一抗 酶标二抗 底物 间接法 1:8000 1:4000 1:2000 1:1000 1:500 对照（0） 抗体浓度 ⑤ ④ ③ ② ① 洗涤液 一抗 二抗 二抗 二抗 二抗 二抗 二抗 OD490 二抗