放射自显影教学课件PPT.pptVIP

一、示踪剂引入的方法 （一）引入途径 （二）引入方法 （一）引入途径 1、体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹腔或直接脑内注射和灌胃等途径引入放射性标记化合物。 2、体外实验：对组织、细胞、体液的培养过程，则可在培养瓶中引入。在离体标本上研究受体等生物活性物质，也常将示踪剂直接加在切片上进行结合反应，然后洗去多余的示踪剂后再进行自显影。 二、放射自显影的标本制备 总要求：标本制备过程不能引起示踪剂的流失或移动。 （一）组织切片 （二）整体小动物或大动物脏器切片 （三）牙齿、骨骼 （四）体液、培养液中的细胞或其他成分 （五）电镜标本 （六）无细胞的标本 （一）组织切片 1、冰冻切片：标本采集后不经固定，直接快速冷冻。冰冻的标本不能反复冻融，直接放置-80℃备用。然后进行切片，切片冷冻干燥后，移入室温后置4℃进行自显影。适用于扩散性示踪实验和需保存生物活性的实验。 2、石蜡切片：标本经固定液固定（福尔马林、多聚甲醛）固定、水洗、脱水、二甲苯浸透、石蜡包埋等过程，常温下切片。标本不宜用含重金属盐的固定液，防止干扰结果。固定后必须充分水洗，制备过程中示踪剂和某些组织成分可能发生扩散或流失，一般只用于非扩散性实验。 （二）整体小动物或大动物脏器切片 实验动物引入示踪剂后，用药物麻醉动物，然后将动物投入干冰丙酮混合液或液氮中快速冷冻，以防组织内形成结晶，待全部冻结，用羟甲基纤维素包埋动物，包埋块在整体切片机上制成切片，再进行自显影操作。 （三）牙齿、骨骼 观察无机成分时，可在磨石上制成磨片。先用10%福尔马林固定，经磨石加水研磨至表面平整的薄片或剖面，然后乙醇脱水、干燥，再进行自显影。观察有机成分时，可脱钙后制成石蜡切片。 （四）体液、培养液中的细胞或其他成分 可直接离心浓缩后制成细胞涂片，培养的细胞也可制备细胞爬片，细胞应制成单层。离体实验中，细胞周围常有大量游离示踪剂，应充分洗涤后再制备涂片。固定涂片的固定液应根据研究对象进行选择，如研究核酸时用甲醇：冰醋酸（3：1），蛋白质则选用10%福尔马林做固定液，干燥后进行自显影。 （五）电镜标本 电镜标本的制备与一般标本制备不同，标本先用2%戊二醛固定，缓冲液洗涤，再用锇酸固定，冲洗，系列丙酮或乙醇脱水，环氧树脂包埋。然后用超薄切片抽切片，切片厚度为50~100μm。再涂核乳胶，进行自显影。 （六）无细胞标本 示踪研究所用的各种电泳谱、色层条、免疫沉淀板，可按常规方法进行处理、干燥，然后再用接触法做自显影。 三、自显影制备 （一）接触法 （二）液体核乳胶浸膜法 （三）揭膜乳胶法 （四）融裱法 （五）金属环法 （一）接触法 在暗室中，将标本面与感光胶片或核乳胶干板的乳胶面密切接触，进行曝光而制备自显影的方法称为接触法。标本与感光材料均不接触水或有机溶剂，不会造成示踪剂的扩散或流失，适用于各种实验。 （二）液体核乳胶浸膜法 在暗室中，将标本或载有标本的玻片浸入适当稀释的液体核乳胶中，使标本表面敷上一层薄而均匀的乳胶膜，干燥后曝光而制备处显影的方法称液体核乳胶浸膜法。在浸膜过程中，标本要与含水的液体核乳胶接触，会造成扩散性示踪剂一定程度的扩散和流失，故只适用于非扩散性示踪实验。 （三）揭膜乳胶法 将揭膜乳胶膜从玻璃基片上揭下来，在温水中展开，浸透，然后将其贴于标本表面，干燥后曝光而制备自显影。揭膜乳胶厚度均匀，该法常用于光镜自显影的定量研究。因需在水中进行，故适用于非扩散性示踪实验。 （四）融裱法 用预冷的核乳胶干板沾取刚刚切下的冰冻组织切片，并使其贴牢在乳胶面上，冻干后进行曝光制备自显影。主要用于光镜自显影的扩散性示踪实验。 （五）金属环法 电镜自显影常用的方法。即将核乳胶在暗室中按1：4与蒸馏水稀释，40℃融化并缓慢搅拌1h，存放4℃过夜使其稳定。然后再融化并搅拌1h，将其冷却到25℃。用不锈钢制成的金属环（10∽30mm）插入核乳胶中，垂直提出，在金属环上便形成一层单层乳胶膜。将其敷在电镜切片所放置的铜网上，4℃曝光制备自显影。 四、自显影的阅读分析 （一）宏观自显影的阅读分析 （二）光镜自显影的阅读分析 （三）电镜自显影的阅读分析 （一）宏观自显影的阅读分析 宏观自显影的影像可直接用肉眼观察。比本底黑的部份即表示放射性示踪剂的存在，黑度越大，表示该处放射性越强，示踪剂分布越多。观察时，需将自显影像与标本重合起来观察，以准确定位。如将自显影像用光密度计进行测量，则可进行定量分析。 （二）光镜自显影的阅读分析 通过在光镜下观察自显影像上银颗粒分布的位置和密度而确定放射性示踪剂存在部位和数量。自显影像上单位面积的显影银颗粒数目，与该处示踪剂的放射性活度呈正比。 光镜自显影的定量分析 二种方法：一是计数被示踪剂标记的细胞或细胞核在细胞群体中所占的百分率，即标记指数。通常一个细胞核上有4个以上银