核酸研究进展-李恩民.pptVIP

First found in C.elegans: dsRNA represses gene expression much more effectively than antisense * 增强或抑制生物系统中目标基因表达 核酸实验研究技术进展－2 增强生物系统中目标基因表达 核酸实验研究技术进展－2 增强生物系统中目标基因表达实验技术路线 确定目的基因 获得目的基因cDNA 构建表达载体 细胞转染 表达效果检测 1. 化学合成法 2. RT－PCR法 3. cDNA文库克隆 关键环节一：合理 关键环节二：筛选 核酸实验研究技术进展－2 来源于PCR产物、cDNA克隆、限制性酶切片段的目的基因可以与供体载体通过BP反应形成入门克隆（entry clone）。 目的基因可以在入门克隆与多种载体间通过LR反应进行转换，形成表达克隆。 核酸实验研究技术进展－2 抑制生物系统中目标基因表达 核酸实验研究技术进展－2 反义封闭目标基因表达技术 反义封闭目标基因表达的两个关键环节： 目标基因转录后剪接加工环节 目标基因mRNA翻译起始环节 核酸实验研究技术进展－2 100. 0 ﹣ 80.0 ﹣ 60.0 ﹣ 40.0 ﹣ 20.0 ﹣ 相对光密度 102.9 100.0 38.2 99.7 1 2 3 4 100.0 106.5 108.6 113.7 100. 0 ﹣ 80.0 ﹣ 60.0 ﹣ 40.0 ﹣ 20.0 ﹣ 相对光密度 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4 M ? 200 bp 600 bp ? NGAL GAPDH NGAL基因转录RT-PCR的检测结果 M, DNA marker, 100bp ladder; 1, SHEEC without plasmid; 2, pcDNA3; 3, pcDNA-NGAL(+); 4, pcDNA-NGAL(-). 核酸实验研究技术进展－2 MMP-9 MMP-2 M 1 2 3 4 kD 212 170 116 76 53 600 ﹣ 500 ﹣ 400 ﹣ 300 ﹣ 200 ﹣ 100 ﹣ 542.6 25.0 1 2 3 4 300 ﹣ 250 ﹣ 200 ﹣ 150 ﹣ 100 ﹣ 50 ﹣ 251.4 3.8 0.0 100.0 MMP-9 相 对 密 度 单 位 1 2 3 4 100.0 0.0 MMP-2 相 对 密 度 单 位 M. 蛋白marker，1. 培养液空白对照，2. 食管癌细胞对照 3. 有义促进NGAL基因表达的食管癌细，4. 反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞 细胞培养上清液中MMP-9和MMP-2的活性 结果表明通过有义、反义技术使NGAL基因表达发生改变可以对食管癌细胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性产生明显影响。 核酸实验研究技术进展－2 食管癌细胞裸鼠移殖瘤HE染色（?400） (A) 对照组：食管癌细胞SHEEC (B) 实验组1：有义促进NGAL基因表达的食管癌细胞SHEEC (C) 实验组2：反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞SHEEC 结果表明，反义封闭NGAL基因表达会明显抑制食管癌裸鼠成瘤细胞的浸润行为。 （A） （B） （C） 核酸实验研究技术进展－2 永生化食管上皮细胞 由永生化食管上皮细胞恶变的食管癌细胞 反义封闭NGAL基 因表达的食管癌细胞 激光共聚焦检测NGAL基因表达反义封闭后食管癌细胞的形态 结果表明，反义封闭 NGAL基因表达后，食管癌细胞 F-actin的分布变得均匀，F-actin小体减少，细胞间连接重新建立，结构较紧密，细胞的整体形态与永生化食管上皮细胞相近。 核酸实验研究技术进展－2 RNA干扰（ RNA interference，RNAi） RNAi的定义 发现RNAi现象的科学意义 RNAi研究发展简史 RNAi 技术路线的选择 RNAi技术应用举例 核酸实验研究技术进展－2 RNA干扰的定义 某些短片段双链RNA能够以序列互补基因mRNA为靶标，促使其降解，高效特异地阻断基因表达，诱使细胞表现相应基因缺失表型。这种现象叫做RNA干扰（ RNA interference）。 核酸实验研究技术进展－2 发现RNAi现象的科学意义 深刻揭示了细胞内基因沉默的机制。 为后基因组时代研究基因的功能提供了有力工具。 核酸实验研究技术进展－2 RNAi研究发展简史 95, Guo and Kemphues, Cell: sense