产绿原酸内生菌细胞色素p450基因的克隆和功能研究.pdfVIP

生物技术通报 ·研究报告· BIOTECHNOLOGY BULLETIN ( ) 2016, 32 6 :181-186 产绿原酸内生菌细胞色素 P450 基因的克隆和功能研究 王川  李丽  魏丕伟  黄非1 1 1 2 （1. 四川理工学院生物工程学院，自贡  643000；2. 四川大学生命科学学院，成都  610064） 摘 要 ： 以一株产绿原酸的内生枯草芽孢杆菌为基础，对其绿原酸途径的关键酶基因进行克隆和功能研究。克隆该内生菌 的细胞色素P450基因并进行原核表达，对重组蛋白进行肉桂酸羟基化酶 （C4H）酶活测定。结果显示，从内生菌中克隆了4个细 胞色素P450酶系基因并进行了原核表达，其中P-4重组蛋白具有C4H活性，产生的香豆酸与LC-MS检测的结果一致，该酶的最 适温度范围较宽，产物香豆酸对该酶有抑制作用。该内生菌可能利用其细胞色素P450酶系作为C4H的同工酶从而将产物导入绿 原酸合成途径。 关键词 ： 绿原酸 ；细胞色素P450；C4H；表达 ；活性 DOI：10.13560/ki.biotech.bull.1985.2016.06.026 Cloning and Function of Gene for Cytochrome P450 from a Chlorogenic - Acid producing Endophytic Bacterium WANG Chuan  LI Li  WEI Pi-wei  HUANG Fei1 1 1 2 （1. College of Bioengineering ，Sichuan University of Science Engineering ，Zigong 643000 ；2. College of Life Sciences ，Sichuan University，Chengdu 610064 ） Abstract:  Based on a chlorogenic acid-producing endophytic Bacillus subtilis ，cloning and function of a key gene in the synthetic  pathway of chlorogenic acid was studied. The cytochrome P450 gene of the endophyte was cloned and expressed in prokaryotic vector，and the  cinnamate 4-hydroxylase（C4H）activity of the recombinant proteins were determined. Four cytochrome P450 genes were cloned and expressed  inprokaryotic vector，and the recombinant protein P-4 presented C4H activity. The coumarate produced by the C4H activity was the same as  the result measured by LC-MS. The activity of P-4 existed in a broad optimal temperature and was inhibited by product coumarate. It is supposed  that，taking cytochrome P450 as isozyme of C4H，the endophyte led the product coumarate to the synthetic pathway of chlorogenic