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实验二、 细胞培养的准备 提 纲 一、培养用具的清洗 （一）玻璃器皿的清洗 玻璃器皿在培养过程中用量大，重复使用频率高，要求严格清洗，特别是与细胞直接接触的各种培养器皿，即使含有微量的化学物质，都会对细胞生长不利。 有害物质包括：解体的微生物、细胞残留物以及非营养成分的化学物质 玻璃器皿的清洗一般包括浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤。 1.浸泡 目的：软化器皿表面附着的物质，同时清除玻璃因为生产工艺而残留的碱性物质和其他有害物质。 方法：一般是在清水（或加有洗涤剂）中浸泡数小时，再经简单的刷洗，然后在5％稀盐酸溶液中浸泡12 h 以上。 注意：污染的瓶子或者培养肿瘤细胞的瓶子，要在2％来苏尔中浸泡过夜。 2.刷洗 目的：去除表面杂质 方法：使用软毛刷，将浸泡后的器皿在洗涤剂中反复刷洗，用力要轻。忌用粗糙的工具抠刮器皿的表面，以免损伤表面并且造成划痕。刷洗不要留下死角。刷洗结束后，用自来水充分冲洗，晾干。 3.泡酸（浸酸） 目的：利用洗液的强氧化性，去除器皿表面可能存在的有机物。新的或者重复使用的器皿一般都需要泡酸，一些无法用毛刷刷洗的物品（如吸管等）通常也主要靠泡酸来去除污物。 方法：将干燥的器皿完全浸入洗液中，培养瓶、试剂瓶等容器要完全充满酸液。浸泡时间应该在6小时以上，最好过夜。 注意安全，防止损伤皮肤、眼睛、衣物！ 洗液：由重铬酸钾、浓硫酸和水配制的清洁液，具有强氧化性和腐蚀性。 使用过程中要注意防护，严防洗液对眼睛、皮肤和衣物的伤害和损坏。 4.冲洗 目的：泡酸后的器皿必须用大量自来水冲洗，以去除残留的洗液。 方法：自来水流应该有一定的压力，每件器皿都要反复注满水、振荡、倾空20次。最后用蒸馏水浸洗3次。烘干后包装。 （二）橡胶塞和塑料制品的清洗 使用后的胶塞要先在水中浸泡，再用2％的NaOH溶液煮沸10分钟。自来水冲洗后， 再用1％稀盐酸浸泡30分钟。最后分别用自来水和双蒸水各冲洗3次，烘干后包装。 塑料器皿在使用后应该及时在水中浸泡，避免附着的物质干涸而难于清理。自来水冲洗，一般不用刷洗。洗干净的器皿先在NaOH溶液中浸泡过夜，自来水冲洗后，再用1％稀盐酸浸泡30分钟。最后分别用自来水和双蒸水个冲洗3次，烘干后包装。 （三）金属器械的清洗 擦去防锈油，然后用70％酒精棉球擦拭，烘干、包扎、灭菌 滤器先用自来水冲净，蒸馏水冲三次，70％酒精擦拭，烘干，加滤膜，包装，灭菌 二、清洗后物品的包装 目的：洗净烘干的物品应该及时包装，以备消毒灭菌。包装的物品便于消毒和贮存，同时可以防止消毒灭菌后再次受到污染。 方法：包装常使用牛皮纸、硫酸纸、纱布、棉布、铝箔、铝盒、搪瓷杯、金属消毒筒等。 三、培养用品的消毒和灭菌 （一）物理方法 1.紫外线（ultraviolet）消毒 原理：紫外线可以破坏微生物的蛋白质和核酸，从而杀灭多种微生物，其中革兰氏阴性菌最为敏感，其次是革兰氏阳性菌，再次是芽孢，真菌孢子抵抗力最强。 用途：直接照射空气、地面、工作台表面。 优点：用法简便，效果好。 注意事项： 紫外线的消毒效果和光源的辐射强度、照射时间成正比。 灯管距离地面2米左右。用30w的紫外灯照射9平方米的房间，每次照射2～3小时。紫外线照射工作台面的距离应该小于1.5米，时间30分钟左右。 紫外线照射效果的影响因素： 温度和湿度 空气要清洁 不能穿透纸张、布等遮挡物 场地和台面经过擦拭后照射效果更好 紫外灯管的使用寿命 2.高温干热灭菌 原理：用电热烤箱内160℃以上的高热，保温90-120分钟，杀死细菌和芽孢，达到灭菌的目的。 适用：不便于在蒸汽压力灭菌锅中进行灭菌且不会被高温损坏的玻璃器皿（如体积较大的培养瓶、烧杯等）、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品（粉剂、油剂）。 橡胶制品和塑料制品不能使用干热消毒法。 注意事项：温度和时间要达到要求。灭菌结束，切忌不要急于开门，应等温度下降冷却后再打开，防止玻璃器皿因为温度骤变而破裂。物品之间应该留有空隙，便于热空气的流动。 烧灼：也是干热灭菌的方法之一。在培养操作中，常常利用操作台上酒精灯或者煤气灯的火焰对金属器皿及玻璃瓶口进行补充消毒。 3.压力蒸汽灭菌 原理：通过高温高压和蒸汽良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而死亡。 适用：最常用的灭菌方法，布类衣物、玻璃器皿、金属器械、胶塞、某些培养液体都可以使用该方法灭菌。 注意事项： 1.保证灭菌锅内有水； 2.物品不要超过消毒筒体积的80％，物品之间要留有空隙，液体容器应该在瓶塞上插入一个5#或者7#针头，或者在玻璃塞和瓶口间夹一个纸条，以平衡内外的气压； 3.水沸腾后，应该排气15分钟； 4.将需要的压力维持一定的时间。 5.排气要缓慢进行，尤其有液体存在时； 不同压力