5.免疫酶组织化学技术.ppt

二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： ● Biotin标记第二抗体 LSAB法 ● HRP标记Avidin 抗原---特异性抗体---Biotin标记第二抗体---Avidin ● HRP复合物 步骤：三步法 特点：敏感性高，特异性强， 方法简便 第六节 多聚合物酶法 多聚合物酶法 HRP---多聚合物---抗体 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining 组织抗原 一抗 HRP 多聚骨架 EPOS 方法 原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP---多聚合物---特异性 抗体。 步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强， 敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵 二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer System 原理：HRP ---多聚合物---第二 抗体 组织抗原 一抗 二抗 酶 多聚骨架 第一步 第二步 EnVisionTM方法 特点： 敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。 第七节 基本操作步骤 ● 4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色， 易弥散，不能久保存 ● 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) ～黄色 AKP底物： AKP常用的底物为α-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB～蓝色 固红TR～红色 第三节 酶标记抗体法 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。 一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原--- 抗体● HRP复合物 组织抗原 第一抗体 过氧化物酶 直接法 步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。 二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原---特异性抗体---第 二抗体● HRP复合物 步骤：二步法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 过氧化物酶 间接法 特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。 第四节 酶 抗 酶 法 ● 制备抗酶抗体 ● 制备PAP复合物 酶桥法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） HRP 一、PAP法 原理：抗原---特异性抗体---第 二抗体（桥抗体）--- PAP复合物 步骤：三步法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 PAP复合物 PAP法 HRP 特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物 二、双PAP法： 原理：在PAP的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物 抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP ---第二抗体--- PAP复合物 组织抗原 第一抗体 第二抗体 PAP复合物 双PAP法 HRP 双PAP法 组织抗原 第一抗体 第二抗体 PAP复合物 HRP 步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特 异背景重 三、APAAP法 原理：抗原---特异抗体---第二 抗体--- APAAP复合物 步骤：三步法 APAAP法 特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂 第五节 卵白素---生物素法