1、2组 实验七 CAME及实验十三 等电点测定.pptVIP

实验七 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳（P46） 电 泳 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳 [定义] [应用] 分离纯化各种物质、鉴定生物大分子 [类型] 醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等 [原理] 蛋白质是两性电解质，其在等电点时呈电中性状态，故在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。 血清中各种蛋白质的等电点多低于pH7.4，因此在pH值比其等电点高的缓冲液（pH8.6）中，它们都解离成负离子，在电场中向正极移动。 各种血清蛋白等电点不同（在同一pH下带电数量不同）以及分子量不同，因而在电场中的运动速度不同。蛋白质分子小而带电荷多者，移动速度快；反之则然。 [原理] 据此原理可利用醋酸纤维薄膜电泳将血清蛋白质按其在电场中泳动的速度快慢分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白等五条区带，这些血清蛋白分离后，用蛋白染色剂进行染色。 血清蛋白 A α1 α2 β γ pI 4.64 5.06 5.06 5.12 6.85~7.5 分子量（万） 6.9 5~20 30 9~15 30 含量百分比％ 57~68 1~6 5~11 7~13 10~18 + - 清蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 [操作步骤] 1. 电泳前准备 (1) 将醋酸纤维薄膜（缩写CAM）切成2cm宽、8cm长的小条。 (2) 浸泡：将薄膜有光泽面向下漂浮于缓冲液中，浸泡5~10min，待膜完全浸透后，取出轻轻夹于滤纸中，吸去多余的溶液。 (3) 点样：在无光泽面距顶端约2cm处，用点样器取血清约2 μl，进行点样。 (4) 上槽：待血清吸入膜后，以无光泽面向下、两端紧贴在滤纸桥上（加血清的一端贴在电泳槽阴极端，切勿使点样处与电泳槽接触），加盖，平衡2~3min，然后通电 2. 电泳 电压：约100~120V 时间：40~60min 3. 染色及漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于丽春红染色液中10~15min，然后取出用漂洗液浸洗脱色，至背景完全无色为止。观察蛋白区带的分布。 [要求] 将电泳后的CAM做好标记后贴在实验报告上 清蛋白 α1-球蛋白 α2-球蛋白 β-球蛋白 γ-球蛋白 - + 实验十三 沉淀法测定蛋白质等电点（P61） [原理] 蛋白质是两性电解质，当溶液置于某一pH值时，蛋白质分子上所带的正电荷数等于负电荷数而呈兼性离子或中性离子，此时溶液的pH值为该蛋白质的等电点。 带负电荷 带正电荷 等电状态 P COOˉ NH3+ OHˉ P COOH NH3+ P COOˉ NH2 P COOH NH2 OHˉ H+ H+ [原理] 在等电点时，蛋白质的粘度和溶解度均降低 本实验使酪蛋白处于不同pH值的溶液中，根椐蛋白质在等电点时溶解度最小的原理，观察沉淀的多少，测定酪蛋白的等电点。 [操作步骤] 1. 取管径大小一致的试管5支，编号，按下表分别加入试剂并混匀。 管 号 1 2 3 4 5 蒸馏水 2.4 － 3.0 1.5 3.5 1.00mol/L 醋酸 1.6 － － － － 0.10mol/L 醋酸 － 4.0 1.0 — — 0.01mol/L 醋酸 － － － 2.5 0.5 酪蛋白 各管分别加入1.0ml，边加边摇，观察混浊度。 最终pH 3.5 4.1 4.7 5.3 5.9 沉淀多少 [操作步骤] 2. 静置30min后观察各管沉淀的量，分别以+、+ +、+ + +或+ + + +表示之。沉淀产生最多的管的相应pH即为酪蛋白的等电点。 酪蛋白的等电点范围：pH4.1~4.5。 [结果表示] 澄清 混浊 絮状 沉淀 上浑 下沉淀 上清 下沉淀 - + ++ +++ ++++ [注意事项] 1. 如果出现两管沉淀量一样，则等电点取两管pH的平均值。 2．下结论时用大约、接近来描述。