Cas9培训技术讲座-2014-09-18.pptVIP

将正反向两个引物进行退火 将退火产物与线性化的质粒连接 转化感受态细胞 转化子鉴定 送2个经PCR验证有阳性条带的菌液去测序 使用质粒提取试剂盒从经测序确认含正确重组质粒的菌液中提取质粒。 文章案例 Effective gene targeting in rabbits using RNA-guided Cas9 nucleases doi:10.1093/jmcb/mjt04 150ng/ul Cas9 mRNA plus 6ng/ul sgRNA RNA-guided endonucleases Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases Hyun-Taek Kim published online November 19, 2013 Genome Res One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering Rudolf Jaenisch Cell153, 910–918, May 9, 2013 Generation of Gene-Modified Cynomolgus Monkey via Cas9/RNA-Mediated Gene Targeting in One-Cell Embryos Cell 156, 1–8, February 13, 2014 Cas9 mRNA (20 ng/ml) and sgRNAs (5 ng/ml) 为什么Cas9是最受关注的？ 原因：构建简单，guide RNA只需17-23个 效率：RNA-DNA蛋白-DNA 可高通量：一次性敲除多个基因 Cas9细胞怎么做 确定待敲除基因的靶位点并设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物） 2. 构建可表达sgRNA的Cas9质粒 3. 含sgRNA 表达元件的Cas9质粒的活 性检测 4. 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系 1，如何设计？以CFTR为例 NCBI中找到对应的exon 2 构建可表达sgRNA的Cas9质粒 将合成的 Oligos 以逐步降温的方法退火成双链，然后与尧顺禹生物提供的 Cas9 质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。 YSY-CRISPR/Cas9 Kit 电转 如293T、3T3等模式细胞或目的细胞 脂转 荧光鉴定转染效率 Puro药筛3-5天 部分细胞抽提DNA、并PCR送测序 通过测序套峰情况初步判断活性效率 PCR产物连接TA克隆，验证准确效率 3 含sgRNA 表达元件的Cas9质粒的活性检测 YSY sgRNA活性检测（专利） 含识别位点的基因组片段（400-600bp） gRNA+Cas9 mRNA 斑马鱼受精卵 发育24hpf YSY 超微量试剂盒 5个胚胎混合制备DNA模板 通过测序套峰情况初步判断活性效率 PCR产物连接TA克隆，验证准确效率 套峰图 4. 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系 电转 目的细胞 脂转 荧光鉴定转染效率 Puro药筛3-5天 其余细胞消化成单细胞克隆，继续培养并结合效率数据筛选获得稳定敲除细胞系 PCR检测单克隆细胞，筛选非3的整数倍突变 稳定建系成功 Cas9动物模型怎么做 体外转录成sgRNA （Cas9的mRNA单独转录，戴帽或加尾） 显微注射到胚胎（斑马鱼、小鼠、大鼠、果蝇、热带爪蟾等） 筛选F0代，内交或与WT杂交 YSY sgRNA活性检测（专利） 构建sgRNA 表达质粒 F1代 细胞基因敲除载体（常规） Cas9基础研究应用：外显子删除 完整的基因敲除方法： 利用ZFN技术进行基因敲除和基因打靶的技术瓶颈 1、构建ZFN很困难，需要进行复杂的分子重组 2、获得有活性的ZFN非常非常困难 研究人员通常还需要验证以及几十个不同的ZFNs，来证明其中一个有效。 /?articles.view/articleNo/39239/title/A-CRISPR-Fore-Cas-t/ Dong et al., 2011. PLoS ONE, 6(12):e28897. 我们的发明：斑马鱼胚胎作为筛选系统筛选 有活性的ZFN Heritable targeted ina