蚕豆病生化设计实验PPT.ppt

2011级临床四大班 第四实验室1,2小组 组员：杨从德（201101171） 王永波（201101168） 武桂芬（201101170） 王小花（201101167） 试验时间:第十八周 (yangcongde@yahoo.cn) 一、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？ 蚕豆病 恶心、呕吐、面色苍白 皮肤及巩膜黄染 红细胞 1.98×1012/L 血红蛋白53g/L 血清总胆红素85.5μmol/L 尿蛋白（++） 尿胆红素(－) 尿胆素原(+) 尿液镜下未见红细胞 黄疸 红细胞膜不完整，已破裂 红细胞含量少 含量明显增加 血红蛋白量减少 排尿呈酱油样色 游离胆红素增加 溶血性黄疸 蚕豆病 肠肝循环增多 蚕豆病简介 蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。 易发人群 多见于儿童，男性患者约占90%以上。 实验原理 一、高铁血红蛋白还原试验 实验原理：在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术） 亚铁血红蛋白 高铁血红蛋白 高铁血红蛋白还原酶 NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体) 实验反应方向 主要试剂：0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 ②、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液③、混合液 （等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂 仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支 高铁血红单白还原实验 实验流程 取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀 抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg) 离心沉淀 1000 r/ min 15 min 调整 血细胞∶血浆=1∶1 ，混匀 → 调整后全血（备用） 1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠 1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混匀 → 混合试剂（备用） 1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基蓝液 高铁血红单白还原实验 实验流程 取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂 　高铁血红蛋白还原试验操作步骤 混合试剂/ mL 0. 01 / / 生理盐水/ mL / 0. 01 / 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠- / / 0. 01 0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1 来回摇动15～20 次,置37 ℃水浴箱静置3 h 蒸馏水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 试剂 A B S 高铁血红单白还原实验 B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管及“S”管吸光度 实验流程 计算高铁血红蛋白还原率 公式：MHb % = (1 - A/ S) ×100 % 高铁血红单白还原实验 二、G6PD荧光斑点试验 实验原理：葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性 NADP NA