多糖类药物的分析幻灯片课件.pptVIP

1 多糖类药物的分析 一、概述 二、多糖的纯度测定 三、多糖分子量测定 四、多糖的含量测定 五、多糖类药物的结构分析 . 2 第一节 概述 1．从动物来源的多糖。 2．从微生物来源的多糖。 3．从植物来源的多糖。 4. 从海洋生物来源的多糖。 3 组成分类： 均一多糖 不均一多糖:不同类型的单糖缩合而成 粘多糖：含氮的不均一多糖 结合糖：肽聚糖、糖蛋白(glycoproteins)和蛋白聚糖 糖蛋白通过糖肽键(carbohydrate-peptide linkage) 将糖链和肽链两部分连接起来,连接方式主要分为β-构型的N-糖苷键和α-构型的O-糖苷键. 4 糖蛋白有三种主要类型 糖蛋白分为三种主要类型：O-糖苷键型糖蛋白、N-糖苷键型糖蛋白和连有磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白。 在大多数的O-糖苷键型糖蛋白中，GalNAc残基通过O-糖苷键与一个丝氨酸或苏氨酸残基连接形成，缩写为GalNAc-Ser/Thr。 在N-糖苷键型糖蛋白中，GlcNAc残基通过N-糖苷键与一个天冬酰胺残基相连，缩写为GlcNAc-Asn。 5 O-糖苷键 N-糖苷键 O- （N-）糖苷键型糖蛋白 6 磷酸乙醇胺残基 磷脂酰肌醇-聚糖的糖蛋白 10 椅式构象 β-D-葡萄糖 α-D-葡萄糖 13 多糖的理化性质 旋光性 硫酸蒽酮反应（620nm） 硫酸苯酚反应(490nm) 氨基己糖——乙酰丙酮(525nm) 糖醛酸——硫酸咔唑(520nm) 14 第二节 多糖的纯度测定 （一）超离心法 （二）电泳法 （三）凝胶色谱法 （四）旋光法 15 第三节 多糖的分子量测定 凝胶色谱法 粘度法 超离心法 高效液相色谱 16 凝胶层析法 凝胶层析法：将分子量不同的蛋白质通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离。 最先淋出的是最大的分子。 Kd = 0， Ve= V0 ； Kd = 1 ， Ve= V0+Vi ； 0＜Kd＜1，Ve=V0+KdVi 。 17 凝胶色谱法 方法： Sephadex G-200，多糖标准品 分部收集，硫酸-苯酚检测，分别求得洗脱体积Ve， Ve与 1gM之间存在着线性关系，绘制标准曲线。 Ve=-KlogM+C 将待测样品上柱，待测多糖Ve。 通过标准曲线求出待测多糖分子量。 18 粘度法、超离心法 粘度法：用已知结构相似的多糖决定K值（ η ＝ K M2），然后测出待测多糖的特性粘数η ，计算待测多糖的分子量。 超离心法：根据测得的沉降系数计算多糖的平均分子量。 19 高效液相色谱法测定分子量及分布 色谱条件： 凝胶柱（分子量大小），示差折光检测器。　　　　 标准曲线： 标准曲线：LogMW = a+b tR MW为重均分子量，tR为保留时间 待测多糖分子量（GPC专用软件）： 　 重均分子量 Mw=∑(RIiMi)/∑ RIi Mi为供试品在保留时间ti 时的分子量，RIi在第i部分中被洗脱物质的量（重量）。 20 第四节、多糖的含量测定 比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法） 生物测定法（肝素钠） 生色底物法（低分子量肝素钠） 21 乙酰丙酮法（elson-morgan）——氨基己糖 原理： 氨基己糖在碱性条件下加热，可与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，该衍生物与对－二甲氨基苯甲醛反应，反应物呈红色，于525nm测定吸收度。 22 硫酸咔唑法测糖含量 硫酸咔唑法—己糖醛酸测定 在浓硫酸中，己糖醛酸与咔唑溶液反应生成的反应物呈红色。 520nm比色 23 硫酸苯酚法测定糖含量（总糖） 原理：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，该单糖在强酸性条件下，与苯酚反应生成橙色衍生物。 它在490nm处有最大吸收，其吸光度与浓度呈线性关系。 24 蒽酮法测定糖含量（总糖） 原理：多糖在浓硫酸中水解后，进一步脱水生产糠醛类衍生物，与蒽酮作用形成蓝色化合物，620nm进行比色测定。 特点：10-100μg范围内其颜色的深浅与糖含量成正比。 灵敏度高。 25 生物测定法－肝素测定 美国药典采用羊血浆法。 即比较肝素标准品和供试品延长血浆凝结时间的作用来测定肝素的效价。 26 生物测定法——肝素测定方法 标准品稀释液的配制:精密量取标准品溶液，按高、中、低剂量组（ ds1 、ds2、 ds3 ）用0.9%氯化钠溶液配成三种浓度的稀释液，相邻两浓度的比值为1:0.7。 供试品稀释液的配制：按供试品的标示量或估计效价（AT），照标准品溶液与稀释液的配制法配成高、中、低（ dT1 、d