医学论文-使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点.docVIP

医学论文-使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点 ???????????????? 作者：史艳侠， 韩文杰， 彭柔君， 张景航， 黄慧强 姜文奇 【摘要】? 【目的】 筛选高效的foxp3 RNA干扰的靶点用于阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因 shRNA 序列，化学合成法合成4条shRNA 序列，构建含foxp3 的靶序列的慢病毒载体；构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点；【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒；成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞；在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3％和95.6 ％的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。 【关键词】? foxp3； FLAG蛋白； 慢病毒载体, CD4+CD25+Treg， RNA干扰 ??? Abstract:【Objective】 To screen the high effective RNA intervening targets of foxp3 gene to block the immunosuppression of CD4+CD25+Tregs. 【Method】 Four shRNA sequences were designed by oligoengine software and synthesized by chemical method. Lentiviral vector that consists target sequences of foxp3 was constructed. The 293T tool cell line that express FLAG fusion protein and target gene was constructed to screen the effective targets for RNA interference. 【Result】 Lentiviral vector that contains foxp3 cDNA sequences was constructed successfully. The 293T tool cells that express FLAG fusion protein and foxp3 gene fragments were constructed successfully. Two effective targets for RNAi were screened in 293T tool cells, the blocking efficiency were 91.3% and 95.6 % respectively. 【Conclusion】 The optimal targets of Foxp3 gene for RNAi can be screened by FLAG fusion protein and lentivirus vector. ??? Key words: Foxp3; FLAG fusion protein; Lentiviral, CD4+CD25+Treg , RNA interfere ?? Foxp3是一种转录抑制因子，是forkhead/winged-helix 家族成员，和细胞生长发育的调控有关[1]，后来越来越多的证据表明foxp3可能是一种CD4+CD25+Treg免疫抑制性调节细胞发育、分化的至关重要的基因，并在其表型和功能的维持中起非常关键的作用[2-5]。目前foxp3基因已经成为免疫治疗的一个重要的靶点，引起越来越多的关注。但是CD4+CD25+ Treg细胞仅占外周CD4+T淋巴细胞的 10%～15%，体外分离的成本高昂而且目前还没有很好的体外扩增方法，这为进一步的体外研究带来很大困难。使用慢病毒为载体进行RNA干扰阻断foxp3的功能并使之能在Treg细胞中长期表达是解决这一问题的较好的方法。Flag是一个由十几个氨基酸组成的蛋白标签，由目的蛋白(target protein)和标签(tag)共同构成的蛋白嵌合体，常标记于重组蛋白质的氨基端以帮助分析靶蛋白的生物学功能，用于目的细胞暂时不易得到或目的细胞转染效率非常低基因靶点的筛选[6]。本实验采用FLAG融合蛋白和foxp3基因共同构建靶基因重组真核表达质粒，瞬时转染进293T工具细胞中，筛选出具有RNAi效率的有效靶点，为进一步敲除foxp3基因功能的免疫治疗研究奠定基础。 ??? 1??