医学论文-人脂肪干细胞结合微载体在生物反应器中向软骨细胞分化.docVIP

医学论文-人脂肪干细胞结合微载体在生物反应器中向软骨细胞分化 ??????? 作者：康红军，卢世璧，许文静，张莉，孙明学，袁玫，赵斌，郭全义 【摘要】? ［目的］探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增并向软骨分化人脂肪干细胞。［方法］将人脂肪干细胞结合Cytodex3微载体在旋转的生物反应器（RCSS）内进行动态培养，应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的脂肪干细胞进行动态观察，并对收获的脂肪干细胞进行SafraninO、toluidine blue染色等组织化学染色及Ⅱ型胶原的免疫化学染色分析。［结果］脂肪干细胞于24 h内贴附于Cytodex3微载体表面，细胞形态为短梭形，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的19倍左右，在微载体上收获的细胞进行番红花O、阿利新蓝染色呈阳性，Ⅱ型胶原染色阳性，均强于对照组。［结论］利用微载体细胞培养技术???简便快速地在体外扩增脂肪干细胞，并成功实现向软骨细胞分化。 【关键词】? 脂肪干细胞； 生物反应器； 微载体； 软骨细胞 　自从2001年Zuk等人［1］从脂肪中提取出了具有多向分化潜能的干细胞后，脂肪干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)以其来源广泛，取材方便，扩增迅速等优点迅速成为了组织工程的研究热点。多项研究证实，ADSCs在体外可以向多种细胞系分化，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、神经及内皮［２、3］。其生物学特性与骨髓基质干细胞非常相似，在组织工程领域颇具应用前景。而软骨是公认的最适于应用组织工程技术构建的组织，因此以ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有很高的实用价值。构建组织工程软骨通常要求短期内获得大量的种子细胞，并且在体外培养过程中能够保持良好的表型。传统的静态培养方式很难满足这些要求，而立体三维动态培养不但可以加速细胞的增殖，而且利于软骨方向分化及表型的维持［４］。因此，本研究利用生物反应器技术结合微载体对ADSCs进行快速扩增同时向软骨细胞方向诱导，旨在观察ADSCs在微载体上增殖分化情况，探讨其未来临床应用的可行性。 　　1? 材料和方法 　　1.1? 材料??? 　　Ⅰ型胶原酶，地塞米松，2磷酸1抗坏血酸，ITS，Cytodex 3(Sigma)，胰酶，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(元亨圣马)，FGF2、TGFβ1(Peprotech,UK),Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体(北京中山公司)，旋转生物反应器(Synthecon)，Olympus倒置显微镜(Olympus)。 　　1.2? 方法　　　　1.2.1? ADSCs的分离培养? 取膝关节置换术中切除的髌下脂肪垫，严格保持无菌，取材后30 min内进行干细胞分离。在超净工作台中，用显微剪刀仔细剔除脂肪组织表面的筋膜和小血管，DHanks冲洗3遍以洗去红细胞的污染。剪碎，加入5倍体积的0.075%的Ⅰ型胶原酶，37℃、搅拌30 min，离心2 000 r/min，5 min，倾去上层脂肪及上清，DHanks洗涤，100目筛网过滤。离心1 000 r/min 5min，沉淀用DHanks洗2遍，将细胞重悬于含10%FBS的高糖DMEM培养基，48 h后换液。细胞长满80%后，用0.25%胰酶消化传代培养。至第2代时，换培养液为软骨诱导液(5 ng/ml FGF2,10 ng/ml TGFβ１，50 μg/ml Vc、10-7M Dexamethasone,1xITS)进行软骨方向诱导分化。 　　1.2.2? Cytodex 3预处理? 取干重微载体珠50 mg，放入10 ml的洁净玻璃瓶中。向瓶中加入不含钙和镁离子的PBS 10 ml，室温下至少孵育3 h以膨胀微载体珠，用巴氏吸管弃去上清液，PBS清洗微载体2次，弃去PBS，再加入新鲜不含钙和镁离子的PBS 10 ml，高压灭菌20 min，吸除上清液，微载体用培养液清洗，置于4℃冰箱中备用。 　　1.2.3? 细胞培养方式? 将Cytodex 3微载体50 mg及ADSCs(最终浓度1×105/ml)加入到10 ml体积的RCSS培养容器中，并补加软骨诱导培养基至充满容器。把接种细胞的容器连接于旋转底座。整个装置放于5%CO2孵箱，于37℃常规条件下培养。开始以5 r/min的速度旋转5 min，以充分混合细胞，然后停止旋转5 min。再旋转容器5 min，再停止容器旋转5 min。多次重复循环，最后持续旋转容器并逐步调整转速至10～12 r/min。视培养基颜色及pH值决定是否换液及换液量。ADSCs静止培养是以1×105/ml接种于6孔板中，每孔2 ml，接种5孔，培养过程中每2～3 d更换培养液，保持细胞供养充足。 　　1.2.4? 细