医学论文-单细胞多重巢式PCR在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究.docVIP

医学论文-单细胞多重巢式PCR在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究 ??????????????????? ?作者：朱琴 徐炳森 黄学锋 周颖 【摘要】? 目的 建立单细胞的多重巢式荧光PCR技术，为开展常染色体显性多囊肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断提供依据。方法 用四重荧光巢式PCR和毛细管电泳对单个淋巴细胞的KG8、SM6、CW4和CW2四个微卫星位点进行多态性分析。结果 单个淋巴细胞KG8、SM6、CW4和CW2扩增成功率分别为85.93％（55/64）、89.06%（57/64）、92.18%(59/64)和89.06%（57/64），KG8、CW4和CW2的等位基因脱扣率分别为25.64%（10/39）、25％（4/16）和7.01%（4/57），两个位点同时发生的ADO率为2.56%（1/39）。结论 该方法为常染色体显性多囊肾疾病行胚胎植入前遗传学诊断提供了依据。 【关键词】? 微卫星 多囊肾 胚胎植入前遗传学诊断 【Abstract】? Objective? To establish the technology of multiple nest fluorescence single cell PCR, for preimplantation genetic diagnosis for autosomal dominant polycystic kidney disease. Method? Use quadruplex nested fluorescent PCR and capillary electrophoresis to analysis the polymorphism type of KG8, SM6, CW4 and CW2 of single lymphocytes. Result? The amplification success rate of KG8, SM6, CW4 and CW2 are 85.93%, 89.06%, 92.18% and 89.06%, respectively, and the ADO of KG8, CW4 and CW2 are 25.64%, 25% and 7.01%, While the ADO is 2.56% in two microsatellites discovered simultaneous. Conclusion? It provide an evidence of using this technique for the PGD for ADPKD. ??? 【Key words】? Microsatellite? ADPKD? Preimplantation genetic diagnosis??? 常染色体显性多囊肾疾病（autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD）是最常见的常染色体显性遗传的单基因遗传病，人群发病率为1/1000［1］。ADPKD的主要表现为肾脏进行性囊性改变，常导致终末期肾病，居我国终末期肾病病因的第4位［2］。除了肾脏病变外，还累及全身多个器官，如肝囊肿、高血压、颅内动脉瘤、心瓣膜畸形等，是一全身性疾病。而且ADPKD具有延迟性发病的特点，其症状发生前检查结果很少能影响未生育患者的生育意向，使其成为最易遗传给下一代的严重遗传病之一。因此，对ADPKD患者进行PGD既可满足患者生育的愿望，又可避免生育患有ADPKD的后代。目前认为，ADPKD主要与PKD1和PKD2基因有关，PKD1突变引起的ADPKD占80%～85％［3，4］，PKD2基因突变引起的ADPKD占10%～15%［5］，这两个基因结构复杂，缺乏突变热点，因此难以通过直接检测突变行PGD诊断。本研究拟利用与PKD1紧密连锁的KG8、SM6、CW4和CW2四个微卫星位点，行四重巢式荧光PCR和毛细管电泳，为ADPKD的PGD研究提供诊断依据。 ??? 1? 材料与方法 ??? 1.1? 实验材料? 任取2位来本中心就诊患者的淋巴细胞64个，其中A患者获取18个，B患者46个。取材均得到患者的同意。 ??? 1.2? 实验方法? （1）单个淋巴细胞制备：先用percoll 60分离出单个核细胞，然后在倒置显微镜下通过显微操作吸取单个淋巴细胞，分别在3滴PBS液中洗涤，同时取最后1个微滴洗涤后液体为阴性对照，将单个淋巴细胞转移于含5μl细胞裂解液的PCR管中，－20℃保存备用。（2）PCR反应：KG8、CW4和CW2的内引物参考文献［6］，其余引物均由primer 3软件自动生成。内引物中正引物均有FAM荧光标记。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体内外引物序列见表1。第一轮P