05蛋白质（III）.ppt

蛋白质（III） ——蛋白质的主要研究技术 蛋白质的性质 胶体性质 蛋白质分子直径在1~100nm范围内 透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开 丁达尔现象 水化现象 吸附现象 酸碱性质 等电点与电场迁移 蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移 一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用氨基酸侧链基团推算。 蛋白质的颜色反应（p35） 双缩脲反应：与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm处有最大光吸收。 米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这是酚类化合物的反应（Tyr） 乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲哚基化合物的反应（Trp），明胶一般无此反应 坂口反应：蛋白质加入次氯酸、?-萘酚、氢氧化钠可以生成红色化合物，胍基反应（Arg） 酚试剂：福林（Folin）试剂，酚基（Tyr）可以把磷钼酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，Lowry法。 光吸收性质 蛋白质在280nm处有强烈的光吸收 Phe、Tyr、Trp Trp贡献最大 蛋白质的沉淀与变性 沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关 改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来 可逆沉淀 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法 根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白质和其他物质分开 等电点沉淀法： 调整pH至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离 适用于区分等电点差异大的亲水蛋白 盐析与盐溶法： 中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用 常用盐析剂：MgCl2、（NH4）2SO4、K2SO4 有机溶剂沉淀法 改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用 常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质 不可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀 变性沉淀因素： 高温 强酸碱 重金属盐 有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱 去垢剂：SDS（十二烷基磺酸钠） 变性后蛋白质化学性质的改变 生物活性丧失 侧链基团暴露（颜色反应增强） 物理化学性质改变：溶解性?、粘度?、扩散系数? 生物化学性质改变：易于酶解 蛋白质的分离纯化 一般流程： 前处理： 分离组织 破碎细胞 去其他组分 注意问题：保持蛋白质的完整和活性 常用方法 超声粉碎 微研磨 酶消化 超速离心 粗分级 常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂 要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能收缩蛋白质溶液 细分级 进一步提纯 常用方法：层析、电泳 规模小，分辨率高 结 晶 只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶 结晶不一定意味着蛋白质已提纯 本身有一定提纯作用。 蛋白质的纯度鉴定 活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性检测来确定纯度 抗原抗体效价法 电泳、层析、超离心等方法 恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否提纯。 根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等 蛋白质分离纯化常用技术 沉降分离（Sedimentation） 蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的差异 差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降速度的差异分离不同蛋白质 单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关 在生物化学中常用沉降系数表征分子量 密度梯度离心 利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密度的物质 常用蔗糖，CSCl等构建 层析、色谱（Chromatography） 分配层析 一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从而区分不同的物质。 常用方式： 分配柱层析 滤纸层析 薄层层析 离子交换层析 气相色谱 高效液相色谱（HPLC） 利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积 溶剂系统采用高压，提高系统速度 离子交换层析 原理： 利用不同离子在不同的pH下与固定相结合强度的差异，使待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交换，而与固定相结合，从而区分不同物质 可分为： 阳离子交换柱：强酸型、弱酸型 阴离子交换柱：强碱型、弱碱型 常用介质： 聚苯乙烯-苯二乙烯树脂 离子交换纤维素 离子交换葡聚糖 洗脱方式 分段洗脱 梯度洗脱 分子排阻层析（m