基因重组和基因工程PPT.ppt

以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章) 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 基因组文库和cDNA文库的构建和筛选 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA PCR技术获得目的基因 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 （二）克隆载体的选择和构建 目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。 （三）外源基因与载体的连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 粘性末端连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 目的基因自连 载体自连 同一限制酶切位点连接 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 平端连接 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 适用于： 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 同聚物加尾连接 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ T(T)nT T(T)nT 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA 3′ 5′ λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP 末端转移酶 + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15oC 重组体 5′ 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工接头(linker)连接 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection) （四）重组DNA导入受体菌 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等 （五）重组体的筛选 (插入失活法) 抗药性标记选择 α互补 利用α互补原理筛选重组体pUC18 原位杂交 Southern印迹 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 免疫学方法 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 小