第七章 酶的定向进化与稳定性探究 酶工程课件.pptVIP

Enzyme Engineering酶工程 第七章 酶的定向进化与稳定性探究 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用 第三节 蛋白质的稳定性 第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理 第一节 定向进化简介 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的策略 一．理论来源 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 化学进化 生物进化：达尔文在《物种起源》中提出以自然选择为基础的进化学说，成为生物学史上的一个转折点。 自然进化 环境压力下物种朝着适应生存环境的方向发展 漫长时间里通过DNA复制发生突变或通过重组，产生了遗传多样性 自发、非常缓慢、自然选择 人为引发、较短时间、人为选择？定向进化 对酶实现定向进化的意义 酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。 选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。 二．概念 酶分子改造 合理化设计：（需要获得酶分子特征、空间结构、结构与功能之间的关系等信息）比如，化学修饰，定点突变 非合理化设计：定向进化，杂化进化 定向进化 定向进化示意图 随机突变+定向选择＝目标突变体 定向进化 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。 在实验室中模仿自然进化的关键步骤：突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类的需要。 定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选） 定向进化的过程 酶定向进化通常分3步进行： １. 通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性； 2. 导入适当载体后构建突变文库； 3. 通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。 澄清一个事实：定向进化不是定点突变 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 三．定向进化的策略 无性进化:易错PCR、化学诱变剂介导的随机诱变、由致突变菌株产生的随机突变 有性进化:DNA改组技术、随机引物体外重组法、交错延伸法 (一)易错PCR(error-prone PCR) 一种相对简单、快速廉价的随机突变方法。 通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现 少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。 关键是控制DNA的突变频率。 易错PCR的不足之处在于： 靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限； 中性突变较多；且较为耗时、费力 获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。此法突变具有一定的密码偏向性。 连续易错PCR(Sequential error-prone PCR) 该方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。 （二）DNA改组技术(DNA shuffling) 又称有性PCR，指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组。 通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 分子育种 单个基因的DNA改组 从突变体基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随机切割 得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环 在PCR循环过程中，随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因，这导致来自不同基因片段之间的重组 DNA改组原理 1. DNaseI 产生随机片段； 2. 随机片段变性； 3. 随机片段复性； 4.延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段 （三）外显子改组（exon shuffling) （四）随机引物体外重组法(RPR) 第一节结束 点击返回 第二节 定向进化的应用 一．提高酶分子的催化活力 二．提高酶分子的稳定性 三．提高底物的专一性和增加对新底物．催化活力的进化 五．对映体选择