第六章 基因文库技术1 基因克隆课件.pptVIP

 第六章 基因文库技术(The technology of gene libraries) 一、基因文库(Gene libraries) 汇集着基因组所有的DNA序列的重组体DNA群体为 基因文库(Gene libraries) 或基因库(gene libraries) ， DNA文库(DNA libraries)。 由基因组DNA所制成的基因文库称为基因组文库 (genomic libraries )，由互补DNA所制成的称为 cDNA文库(cDNA libraries )。 (bank，libraries， pool，reservoir) 二、基因组文库（ genomic library） 1、基因组文库的概念 将某种生物的全部遗传组成（DNA）切成适当长度的片段，连接在载体上，转化到宿主细胞中而构建的基因文库，就称为基因组文库。 2、构建基因组文库的步骤 Preparation genomic DNA Producing DNA fragment by restriction endonuclases Creating recombinant DNA by ligase Transformed into competent cell Screening the target DNA 为了要分离到一个确实含有目的基因的克隆，究竟要筛选多少个重组体克隆呢？ 3、基因组文库的大小 1976年，L.Clark和J. Carbon提出了一个经验公式： N=ln(1-p)/ln(1-x/y) N: 完全基因文库所应包含的重组DNA的转化子克隆数（基因文库大小） P：在重组体群体中出现目的基因序列的概率（一般为99%） X：文库中每个克隆所含的外源DNA片段的平均长度 Y：该生物基因组的大小（单倍体基因组长度） 举例： 为了获得猪垂体生长激素 PGH 基因，用猪垂体细胞分离制取构建 PGH 基因文库时，用上式计算， X：插入的DNA片段平均长度16kb, Y：单倍体长度3.30×106kb， N=9.67×105个，如果实验中得到106个重组噬菌体，符合基因组文库大小的要求，即99%可能筛选出所需的PGH基因。 三、cDNA文库 1、概念： 通过一系列的酶催作用，使总Poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化给大肠杆菌寄主菌株的细胞内。如此便构成了包含着所有基因编码序列的cDNA基因文库 。 2、cDNA文库构建的具体步骤 分离细胞总RNA,然后从中纯化出主要含mRNA的部分 合成第一链cDNA oligo(dT)引导的cDNA合成法、随机引物引导的cDNA合成法 将 mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子　 自我引导合成法、RNaseH酶降解取代法 将 cDNA甲基化及加连接子 将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上 导入寄主细胞增殖  总RNA的完整性的鉴定 用纤维素柱纯化poly(A) mRNA的流程示意图 libraries 以λ噬菌体构建cDNA文库 N= P为文库中包含细胞中任何一种mRNA序列信息的概率,通常设为99%; N为文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数; n为细胞中最稀少的mRNA序列的拷贝数; T为细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数. ln(1-P) ln(1-n/T) 3、cDNA文库的库容量计算： 4、cDNA文库的优点 1、cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用。因为它们的增殖并不经过DNA中间体。 2、cDNA基因文库的筛选简单易行。 3、每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性几率比较低。 4、克隆在细菌中表达的基因和基因序列结构的测定。 5、表达序列标签的研究（expressed sequence tags,EST) 5、cDNA文库的应用 用于筛选基因。通过cDNA文库筛选获取较为完整的cDNA片段。 构建表达型cDNA文库,通过筛选特异性表达蛋白质分离基因。 用于分离发育阶段特异性及组织特异性基因。