精准溯源-全式金.PDF

唯我所欲、精准溯源 —qPCR全解析 • qPCR 技术 概述 • 绝对定量VS 相对定量 • 一步法VS 两步法 qRT-PCR 样品准备 • 核酸提取 • cDNA 合成( 两步法 qRT-PCR) • 引物设计方法和原则 实验设置 • 必要的对照、内参、标准 • 选择相应的荧光检测方法 • 试剂选择 • 分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线 数据分析 • 实验常见问题分析 2 • qPCR 技术 概述 • 绝对定量VS 相对定量 • 一步法VS 两步法 qRT-PCR • 核酸提取 样品准备 • cDNA 合成( 两步法 qRT-PCR) • 引物设计方法和原则 • 必要的对照、内参、标准 实验设置 • 选择相应的荧光检测方法 • 试剂选择 • 分析扩增曲线、溶解曲线和标准曲线 数据分析 • 实验常见问题分析 3 qPCR 基本概念 4 常规PCR与实时荧光定量PCR • 常规PCR ：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析 • 实时荧光定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应 中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分 析 5 荧光定量PCR仪器工作原理 • 激发光发射源 • 接收装置 • PCR反应模块 6 qPCR 参数: 扩增曲线 扩增曲线、标准曲线反映qPCR 重要指标 qPCR 参数: 融解曲线 溶解曲线(下左) : 温度和荧光值的关系，在扩增结束后进行 处理后溶解曲线 (下右): 温度和荧光值的关系，并取其导数，更为常用 应用:指示特异性，最为理想的为单峰；如出现多峰证明反应不特异或存在引物二聚体 确认反应特异性，增加数据可信度 qPCR 的数学原理 • 理想的PCR反应：