螺旋藻制备高活性小肽的研究.docVIP

螺旋藻制备高活性小肽的研究 　　摘要：以螺旋藻为原料，使用毕赤酵母发酵所产生的蛋白酶对其水解制备了高活性小肽。对酶解工艺条件进行研究，根据正交试验设计原理，在单因素试验的基础上，以DH和TCA-SNI为指标，对影响螺旋藻水解的各种影响因素：温度、pH、料水比、酶底比和时间进行了系统研究，得到了最佳工艺条件为：料水比1∶8、酶底比700 U/g、酶解温度55 ℃、pH值8.5，酶解时间3 h。在最佳条件下制备螺旋藻活性肽的水解度（DH）为11.82%，三氯乙酸-可溶性氮指数（TCA-SNI）为55.13%。利用凝胶过滤色谱法对酶解产物进行分子量的测定，结果显示：分子量小于1000 Da的寡肽占55.02%，小肽分子量分布主要集中在260 Da附近，约2个氨基酸残基，含量为29.07%。制备的螺旋藻肽粗蛋白含量为62.52%，总磷含量为1.00%，钙含量为0.13%，铁含量为803 mg/kg。 　　关键词：螺旋藻；酶解；活性肽 　　中图分类号：Q946 　　文献标识码：A 文章?号：1674-9944（2017）23-0023-04 　　1 引言￣ 　　螺旋藻又称蓝细菌，是一种丝状多细胞螺旋体的原核藻类生物，属于蓝藻门颤藻科。螺旋藻具有很高的营养价值，其蛋白质含量高达60%～70%，是目前已知食物中最高的[1]，而且含有丰富的氨基酸、维生素、脂肪、类胡萝卜素、多糖以及矿物质[2]，是人类理想的食物及药物资源。螺旋藻是安全无毒的，早在400年前墨西哥等地已经开始食用螺旋藻[3]，所以螺旋藻具有广阔的开发前景。 　　生物活性肽是由氨基酸组成的具有生物活性的肽类化合物。小分子的活性肽不仅能够提供机体生长发育所需的营养物质，而且具有增强免疫力、抑制细菌、抗氧化等功能[4，5]。与游离氨基酸和蛋白质相比，肽能够更好、更快地被机体吸收[6]。因此，越来越多的研究者开始关注生物活性肽，小肽的制备及其所具有的生物活性已经成为研究的热点，并且取得不少的成果[7～9]。近年来，生物活性肽作为一种新型的饲料添加剂日益受到人们的关注，目前酶解螺旋藻制备活性肽的研究较少。笔者以螺旋藻为主要原料，对酶解螺旋藻蛋白制备高活性小肽的工艺进行研究，为蛋白小肽类饲料添加剂的产业化进程提供理论依据。 　　2 材料与方??? 　　2.1 实验材料和试剂 　　螺旋藻：北海生巴达生物科技有限公司；毕赤酵母蛋白酶：华中农业大学生科院发酵工程室；其余试剂均为分析纯。 　　2.2 主要实验仪器 　　PL303电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；FOSS DT208型消化炉：苏州安创仪器有限公司；Hlanon K9860凯氏定氮仪：济南海能仪器有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司生产；高速冷冻离心机：香港力康生物医疗科技控股有限公司；722S 可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司制造；Superdex Peptide 10/300 GL 层析柱：美国GE Healthcare公司；KQ3200E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限责任公司。 　　2.3 实验方法 　　2.3.1 螺旋藻蛋白含量的测定 　　参照国家标准GB/T 6432-94《饲料中粗蛋白测定方法》[10]进行测定。 　　2.3.2 毕赤酵母蛋白酶活力的测定 　　采用国家标准GB/T 23527-2009 《蛋白酶制剂》[11]中的福林法进行测定。 　　2.3.3 螺旋藻酶解方法 　　称取一定量的螺旋藻，按照设计好的比例加入适量的水，用1 mol/L NaOH溶液调节体系的pH值，加入一定量的毕赤酵母蛋白酶在适宜的温度下进行酶解，反应结束后置于沸水中灭酶活10 min，迅速冷却，6000 r/min离心10 min，收集上清液测水解度（DH）和三氯乙酸―可溶性氮指数（TCA-SNI）。 　　2.3.4 水解度（DH）的测定 　　采用茚三酮比色法[12]。 　　DH（%）=A1000×W×V1×100V2×100% 　　式中：A为查表得蛋白质的毫克数（mg）；W为称样重（g）；V1为水解夜的总体积（mL）；V2为显色时所用稀释液的体积（mL）。 　　2.3.5 三氯乙酸――可溶性氮指数（TCA-SNI） 　　TCA-SNI（%）=三氯乙酸中可溶性氮含量/原料中总氮含量×100% 　　2.3.6 凝胶过滤色谱法 　　将Superdex Peptide 10/300 GL层析柱用0.05 mol/L，pH 4.5的醋酸盐缓冲液平衡过夜。酶解液于10000 r/min离心10 min，取上清液过0.2 μm的微孔滤膜，然后取500 μL上样测定，洗脱液为0.05 mol/L的醋酸盐缓冲液，洗脱速度为0.