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高效液相色谱仪实用技术 Contents 一、HPLC的基本结构 高压输液泵 往复柱塞泵结构 a. 低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。 b.高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱 六通阀的结构原理 二、仪器的日常清洗与维护 三、常见故障的排查及解决 6、靠近死时间处经常出现负峰 原因： 样品溶剂吸光度低于流动相 洗脱出的物质在该波长无吸收 解决方法： 用流动相溶解样品 若不对测定造成干扰可以不予处理 7、液相峰分叉或肩峰 原因：（首先要确认是否两个物质未分开） 柱效降低，分离能力降低 解决方法： 冲洗柱子，用有机溶剂进行柱再生 倒用 废弃换新柱 8、峰展宽 原因： 流动相选择不合适（比例、种类） 柱效下降 解决方法： 查化合物理化性质，调节pH抑制解离 更换溶剂类型 更换色谱柱 Extra 液相方法摸索： 1、了解药物的组成成分 2、了解各成分的理化性质-药典及文献 3、选择适宜的检测条件： 样品前处理条件的选择 检测器的选择 洗脱方式的选择 流动相的选择 4、预实验：线性、提取回收率、稳定性 欢迎批评指正 Company Logo CompanyLOGO HPLC的基本结构 1 仪器的日常清洗与维护 2 常见故障的排查及解决 3 HPLC 储液器 进样器 数据处理系统 色谱柱 高压输液泵 （在线脱气） 检测器 Waters Acquity UPLC 耐高压（150 ~ 350 × 105Pa） 耐腐蚀 密封性好 无脉动或脉动极小，流量恒定（RSD0.3%） 补充：1bar ≈14.5psi = 105Pa（145psi = 1MPa） 高压输液泵要求 高压输液泵类型 恒压泵 恒流泵 螺旋传动注射泵 往复柱塞泵 1、储液器 流动相 过滤：微孔滤膜的选择 脱气：脱气方式 储存方法 2、泵的维护 流速的升起与降低 流动相是否充足 梯度洗脱在线脱气保持开启 3、六通阀的使用及清洗 推荐清洗方法： 在load与inject之间切换清洗 推荐使用方法 完全填充环：进样量为定量环体积的2~5倍 部分填充环：进样量不大于定量环体积的1/2 （注：阀切换速度过慢会对泵造成损伤，并影响进样量的准确度） 4、色谱柱的维护及清洗 柱接口的维护 预柱的清洗：3阶段 反相键合相色谱柱的清洗顺序：由样品和流动相组成决定 5、检测器的维护 氘灯（寿命2000h左右） 不宜频繁开关 不使用时最好关闭 冲柱时可以不接检测器 1、泵前流路气泡 原因： 滤头堵 流动相脱气不彻底 解决方法： 拆下滤头用纯水和甲醇各超声10min 将流动相摇匀后超声10min（1000ml） 打开旁路purge 2、物质保留时间重现性差 原因： 流动相比例不一致 梯度洗脱平衡时间不足 泵稳定性不好 解决方法： 由同一人配制并使用同一套量器 延长平衡时间 单向阀污染，清洗单向阀（不建议） TEXT TEXT TEXT 3、柱压不正常升高 原因： 管路堵 色谱柱堵 排查步骤： 按流路顺序方向依次排查 分析原因： 流动相中盐析出或是其他原因 解决方法： 用适当溶剂冲洗或超声清洗管路 用适当溶剂冲洗色谱柱 4、出不规则锯齿状峰，噪音异常变大 原因： 静电干扰 检测池污染 检测池有气泡 灯能量不足 解决方法： 接地 用适当溶剂低流速冲洗 排气（注意） 5、基线漂移 原因： 等度-柱平衡不足 梯度-某一相有紫外吸收、检测波长接近末端吸收 解决方法： 多平衡一段时间 向两相中加入等比例的盐或酸，尽量避免使用末端吸收 Company Logo