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细胞培养基本技术 基础知识 细胞培养的基本概念 在体外模拟体内生理环境等特定条件下,将组织或细胞进行孵育培养,使之生存并维持其结构和功能的方法. 基础知识 基础知识 原代培养: 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 传代培养： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 体内培养: 将实体瘤细胞直接接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤细胞，将这种腹水反复传代。 基础知识 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子、生长因子 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒  实验准备 细胞培养室： 无菌操作区、清洗准备区、消毒无菌区、物品储藏区、培养孵育区、研究观察区 培养室仪器： 超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、微孔板 震荡器、液氮罐、水浴锅、离心机、电动吸引器等 培养用耗材： 培养瓶、吸管、培养板、冻存管、记数板等 实验准备 实验准备 基本技术 培养用器皿的清洗、包装、消毒 无菌操作 培养细胞的观察、检测 培养细胞的传代 培养细胞的冻存与复苏 清洗包装消毒 清洗： 浸泡、刷洗、 浸酸（酸液配方：重络酸钾、浓硫酸） 冲洗（流水10遍、蒸馏水3遍） 包装：牛皮纸（密闭封口） 消毒：紫外线、消毒剂、干热消毒、湿热消毒、滤过消毒 无菌操作技术 环境的无菌处理 操作手法 培养用品的无菌处理 细胞传代方法 目的: 原代细胞培养成功后,或传代细胞生长到一定的数量时,需要进行分离培养,否则细胞会因生存空间不足或密度过大,影响细胞生长. 细胞由原培养瓶分离稀释后传到新的培养瓶中的过程称之为传代培养. 细胞传代方法 基础知识 贴壁生长细胞传代方法： 1. 吸光培养瓶中的培养液 2.加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10 min（显微镜下动态监测）。 3. 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4. 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5. 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。 6. 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 7. 将后者放入培养箱中培养。 培养细胞的观测 常规观察: 1 细胞形态: 轮廓是否清晰？ 胞质中是否出现空泡、脂滴或其它颗粒物？ 细胞间隙是否加大？ 细胞形态是否不规则？或失去原有特征？ 2 细胞生长：是否老化？ 3 培养液：是否浑浊？是否变色？ 4 微生物污染：培养液浑浊变色？细胞脱落？菌丝？ 特殊观察: 一 细胞记数： 取待测细胞悬液0.1ml加D-Hanks液0.9ml混匀后，滴入细胞记数板内，于低倍下记数4角的4个大方格内的活细胞数： 细胞浓度= 4个大方格内的活细胞数/4×104×稀释倍数（10）=细胞数/ml 二 细胞活力测定： 是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。 1.台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 已淘汰 2. 四唑盐（MTT）比色法商品名为噻唑蓝 四唑盐比色法的原理： 活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。 细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。  当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 低温保