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鸡卵粘蛋白的分离纯化及分子量测定 作者： 摘要 本实验为了对鸡卵粘蛋白进行活性及分子量测定，主要参照kassell所述的方法，先将鸡蛋清经三氯乙酸——丙酮溶液处理，除去沉淀物，然后经丙酮分级沉淀获得粗品。再经过DEAE纤维素柱层析纯化而得到合格产品。 最后用凝胶电泳法测得粘蛋白分子量。 关键词：鸡卵粘蛋白 分离纯化 分子量测定 ABSTRACT The experiment aim to mensurate CHOM’s activity and molecular weight,which mostly according kassell’s way.firstly,we should remove the egg white’desposit with TCA and ace,then acquire the gruff product from grade deposition.then we can get the eligibility product from DEAE fibrin cornice.at last,we can know the mensurate protein’s molecular weight by gelelectrophoresis . Key words: CHOM separation and purification mensurating molecular weight 一、前言 鸡蛋卵蛋白（chicken ovomucoid简称CHOM）是由鸡卵清中制成的一种糖蛋白，具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究也可将其制成吸附亲和剂，通过亲和层析记得户有效的分离和纯化胰蛋白。鸡卵粘蛋白至今还未能获得单一组分的制品，在电泳行为上常成步均一性。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差别，鸡卵类蛋白N-末端基为丙氨酸。卵类粘蛋白在中性活酸性溶液中对热和高浓度的脲是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其温度较高是易迅速失活。鸡卵粘蛋白除对牛和猪饿胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定抑制作用，另外对人的胰蛋白酶液无明显抑制作用。 二、正文 1.材料及方法：（鸡卵粘蛋白的提取） 1.1材料及主要试剂：丙酮、0.5M三氯乙酸、0.02MPH6.5磷酸盐缓冲液、DEAE-纤维素、氯化钠，0.5M氢氧化钠溶液、0.5N盐酸、鸡蛋清、 1.2.仪器：721分光光度计，水浴锅，核酸蛋白检测仪，电泳仪等 1.3.方法 1.31粗品的制备；取一枚鸡蛋的鸡蛋清30ml加入50ml量筒中，做好记录。三氯乙酸-丙酮溶液按1：2比例混匀，用100ml烧杯取30ml混合液,不断搅拌下在鸡蛋清中加入等体积的以上混合液。30℃水浴继续搅拌30min，（由于疏忽滴漏一部分）。离心20min的到上清液28ml放入小烧杯中，调PH到3.5附近。加入等体积的标准冷丙酮（46ml）4℃冰箱中沉淀2h.离心20min，取2~3ml水溶解沉淀，透析。透析液中加入1/10体积的0.2mol/Lpbs(pH6.5)0.02mol 1.32纯化 DEAE的处理 装柱 上样，用相同的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集卵类粘蛋白部分。 1.33蛋白质浓度的活性测定（Folin法试剂法） 表一：活性测定加样表 步骤 管号 1 1* 2 2* 3 3* 1 2%酪蛋白（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 40℃预热5min 2 样品（ml） 0 1.0 0 1.0 0 1.0 3 0.4M三氯乙酸（ml） 2.0 0 2.0 0 2.0 0 40℃水浴10min 4 样品（ml） 1.0 0 1.0 0 1.0 0 40℃继续水浴10min 5 0.4M三氯乙酸（ml） 0 2.0 0 2.0 0 2.0 过滤，得酶促反应液 反应液（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.4M碳酸钠（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Folin乙试剂（ ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 40℃水浴20min后，测定A680nm 注：1和1*为胰蛋白酶T0.4mg/ml 0.5ml+0.5mlPH8.0的pbs. 2和2*为粗粘蛋白0.5ml+0.5mlT 40℃保温10min 3和3*精提粘蛋白0.5ml+0.5mlT 40℃保温10min 1.34蛋白质分子量测定 表二：胶配制加样表 12%分离胶的配制：（总体积5ml ） 3.6%浓缩胶的配制 （总体积2ml） 30%胶母液 2.0ml 0.24ml PH8.9buffer 1.25ml 0.5ml 无离子水 1.7ml