酶学第四讲.ppt

第四章 酶的催化机制 酶分子在一级结构的基础上盘绕折叠成特定的空间结构（即三维结构）才具特定的催化功能。其中包括二级结构（主链碳原子局部空间排列，即a螺旋、β折叠和β转角），三级结构（在三维空间中折叠成紧密的近球状结构）和四级结构（寡聚酶的亚基之间的相互结合）。 酶的高效率、高度专一性和酶活可调节等催化特性，都与酶蛋白本身的结构直接相关，酶蛋白的一级结构决定酶的空间构象，而酶的特定空间构象是其生物功能的结构基础。 人们只有更深入地认识酶、才能更好地控制酶和应用酶，即在不断研究酶的结构和功能的具体关系和催化机理的基础上，才能研制新的酶类，开发出更广泛的用途。 第一节 酶的活性部位（活性中心） 酶的活性部位是指酶分子中结合底物并催化底物转化成产物的区域。活性部位包括底物的结合部位和催化部位。参与底物结合的氨基酸残基称为结合基团，直接参与催化过程的基团称为催化基团，这些氨基酸残基在一级结构可能相距很远，但在空间结构中却相距很近，处于酶分子的表面并组成一个裂隙和流水口袋。 一、活性部位在整个酶分子中只占很小一部分 酶与其他蛋白质一样，是一个结构极其复杂的大分子，而参与底物结合和催化的基团，则只是少数几个氨基酸残基。作为活性部位的裂隙只占酶分子中很小的一部分。 二、 活性部位是具有三维结构的裂隙 酶的活性部位具有复杂三维结构的形态，构成活性部位的氨基酸残基处于酶分子一级结构上的不同部位，有的残基相距很远，然而在空间结构上却相距很近，可协同结合和催化底物。 例如溶菌酶分子中有129个氨基酸残基，活性部位的重要基团则是由Glu35，Asp52，Trp62，Trp63和Asp101残基提供的。 三、底物与酶活性部位是通过次级键结合的 酶与底物的复合物ES的平衡常数在10-2～10-8mol／L的范围内，其相互作用的自由能变化相当于-3～-12kcal／mol的范围。我们知道，共价键的自由能变化在-50～-110kcal／mol的范围内，相比之下，底物与酶的结合力是很弱的。 第二节 酶的活性部位的研究方法 一、发现与证实 ChT（胰凝乳蛋白酶）241个氨基酸，分子量25700。此酶可水解芳香族氨基酸的羧基端形成的肽键；可水解芳香族氨基酸的羧基端形成的酯键。 设计人造底物——乙酰酪氨酸乙酯。由于底物很小，故它与酶只是点接触，而酶又能使其水解，说明酶分子直接参与酶催化的部位只不过是一小部分。 溶菌酶129个氨基酸，分子量14600。水解细胞壁（多糖）而溶菌酶直接接触的只是六个六碳糖，也说明酶分子只有小部分参与作用。 I（抑制剂）→二异丙基氟磷（DFP） ChT + DEP →活性丧失 经测定DEP与ChT的195位Ser结合，而ChT有27个Ser，只与195-Ser结合，可见此Ser与其它Ser性质不同，可能处于特殊部位。 ChT酶原与ChT结构很相近，但DEP + ChT酶原→不结合 不结合者无酶活，可以推测抑制剂结合的部位可能是活性中心 二、活性部位含义 酶的活性部位是酶分子的一小部分，是酶分子中与底物结合并催化反应的场所。 活性部位是由几个氨基酸侧链基团组成（包括辅酶、金属离子等），它们在一级结构中位置可能很远，但形成空间结构后位置很近，活性部位实质上是某一空间区域而不是一个点或面。 酶的活性部位包括底物结合部位、催化部位。 羧肽酶A（全酶）活性部位：Tyr，Arg，Glu；Zn++。 三、催化部位和结合部位 催化部位是催化反应中直接参与电子授受关系的部位，经研究ChT的催化部位已清楚，其电荷传递系统为Asp102 ——His57——Ser195（*一级结构较远但空间位置较近） 而T（胰蛋白酶）具有与ChT相同的催化部位。 ChT Gly障碍小，故芳香族氨基酸易进入，因此水解芳香族氨基酸羧基形成的肽键 T Asp-则易结合带正电的氨基酸，故水解碱性氨基酸羧基形成的肽键 酶活性部位的氨基酸组成直接影响其特异性，即二者结合部位不同。 四、酶活性部位的研究 主要方法是化学修饰法，其它方法包括反应动力学法、光谱法、X光衍射法（结果可靠，但必须是晶体）。 化学修饰法： 蛋白质+化学试剂——反应——引起某些氨基酸残基或某些基团的共价的化学改变即化学修饰。此化学试剂叫化学修饰剂。 如何确定修饰试剂是结合在活性部位的基团上，而不是结合到活性部位以外的基团上呢？首先要求加入修饰试剂后，酶计量失活（平行失活），其次还要根据不同的情况作进一步确定。 计量失活：加入几摩尔修饰剂就有几摩尔的酶100%失活。 特殊基团————非特异性试剂 使用此种试剂要求: ? Y只能在活性部位中有，其它部位没有。 例：木瓜蛋白酶有7个Cys，其中6个形成-S-S-；1个Cys。 Cys+碘乙酸 ——— 计量失活 故Cys在活性部位上。