酶工程3-1.ppt

D．硅烷化法 载体活化：重氮化 与酶共价偶联 E ．溴化氰法 用溴化氰（CNBr）在碱性条件下活化多糖类物质，载体的羟基与CNBr 反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下可与酶分子的氨基偶联。 常用多糖载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。 溴化氰亚氨碳酸基偶联法 OH OH BrCN H2O O O C=N-E O-CO-NH-E OH O-C-NH-E NH OH H2N-E （多羟基载体） O-CONH2 OH （惰性） O O C=NH （活泼） O—C —N OH 亚胺碳酸基 E ．溴化氰法 （三）交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 （三）交联法常用试剂 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱(shiff) 交联法一般步骤： 第一步形成可溶性分子间交联络合物，第二步是快速反应导致固化。 席夫碱：是指含有亚胺或甲亚胺特性基团（－RC=N－）的一类有机化合物，通常席夫碱是由胺和活性羰基缩合而成 OHC(CH2)3CHO 戊二醛 H2N-E N -HC=N-E-N=CH（CH2）3-CH=N- E- N CH CH （三）交联法—戊二醛交联法 （三）交联法的形式 交联法有4种形式： 酶直接交联法 酶辅助蛋白交联 吸附交联法（壳状固定化酶） 交联包埋法 1.酶直接交联法 在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。 将0.2%木瓜蛋白酶和2.3%戊二醛在pH5.2-7.2，0℃条件下反应24h，便可完成交联反应，生成不溶性固定化酶。 2.酶辅助蛋白交联 为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个载体蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。 交联过程中因化学修饰酶失活，或酶量有限时，可用该交联方法 将100mg脲酶与2.5ml含8%白蛋白，2%戊二醛0.02mol/L pH7磷酸缓冲液混合，冷却到-10℃ ，然后在冰箱中缓慢升到4 ℃，放置4小时后，将形成的泡沫状聚合物彻底洗涤，冷却后粉碎即成固定化酶。 3.吸附交联法 先将酶吸附在硅胶、皂土、氧化铝、球状酚醛树脂或其他大孔型离子交换树脂上，再用戊二醛等双功能试剂交联。得到的固定化酶也可称为壳状固定化酶。 载体的选择性吸附有一定的纯化作用，尤其适用于用发酵液或粗酶液直接固定。 酶分子间的共价交联是其能较牢固地结合于载体上，且酶分子分布于载体表面，使酶与底物接触良好。 4.交联包埋法 把酶液和双功能试剂（戊二醛）凝结成颗粒很细的集合体，然后用高分子或多糖一类物质进行包埋成颗粒。 交联包埋法可以避免颗粒太细的缺点，同时制得的固定化酶稳定性好。 （四） 包埋法 定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。 方法：聚合物单体与酶溶液混合，再借助于聚合助剂（包括交联剂）的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。 操作简单，条件温和，很少改变酶的结构，酶活较高，适用于大多数酶及微生物细胞。缺点是只有小分子底物和产物能透过凝胶网络，对大分子底物不适用，同时凝胶网络扩散阻力较大，可降低酶活。 按类型分为网格型和微囊型 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法，也称为凝胶包埋法。常用聚合物有聚丙烯酰胺、海藻酸、角叉菜胶等 酶包埋在聚合物的凝胶格子中，格子的结构可以防止酶渗出于周围培养体中，但是底物仍能渗入这格子内与酶相接触，使之处在不脱离状态下，达到固定化酶的目的。可将块状聚合形成的凝胶切成小块，也可以将酶包埋在珠状聚合物中。 1．网格型包埋法 聚丙烯酰胺——最常用的包埋载体之一 ： 聚丙烯酰胺是由单体——丙烯酰胺和双体——交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合而成的。丙烯酰胺和双丙烯酰胺都是有毒的，但聚丙烯酰胺凝胶通常认为是无毒的。 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入催化剂使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。 优点：聚丙烯酰胺凝胶机械强度高，有弹性，透明，化学稳定性好，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶解；可以通过改变浓度和交联度，在广泛的范围内调整孔径大小；在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以改善酶脱落的情况。  1．网格型包埋法