4.1生物成分的分离与测定技术(DNA的粗提取).docVIP

第四章 生物化学与分子生物学技术实践 4.1生物成分的分离与测定技术（DNA的粗提取） 探究目的： 1．说出DNA的物理、化学性质。 2．概述DNA粗提取和鉴定的原理。 3．尝试对动物或植物组织的DNA进行粗提取。 探究预习：DNA的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。总DNA的有,效提取要求材料中的DNA尽可能少的,降解。不同的研究目的对DNA的纯度,和量的要求不尽相同。 一、提取生物大分子的基本思路 1．基本思路：选用一定的_______方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。（物理或化学） 2．提取DNA的方法 (1)概念：利用DNA与RNA、______和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（蛋白质） (2)原理：①分离：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的___溶液中溶解度不同，利用这一特点选择适当的____就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。（NaCl 盐浓度 ） ②提纯：a．DNA不溶于__________，但是某些蛋白质则可溶于其中。(酒精溶液) b．蛋白酶能水解蛋白质，但是对_______没有影响。(DNA) c．大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温而发生变性，而DNA在_____ 以上才会变性。(80 ℃) d．洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。 利用以上原理可以将DNA与蛋白质进一步分离。 ③鉴定：在沸水浴的条件下，DNA被________染成蓝色。(二苯胺) 思考：为什么选用鸡血作实验材料？用哺乳动物的血作实验材料可以吗？ 【提示】　鸡血经济且易制得，鸡血红细胞、白细胞都具有细胞核，含大量DNA。哺乳动物的红细胞没有细胞核，DNA含量较低，因而不宜作实验材料。 二、操作提示 1．以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g____________，防止血液凝固。(柠檬酸钠) 2．加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用______________时,动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。(玻璃棒搅拌) 3．二苯胺试剂要___________。(现配现用) 【解读】　提取DNA的方法 1．DNA粗提取的原理 DNA与蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同。 ? 溶解规律 2 mol/L NaCl 0.14mol/L NaCl DNA 溶解 析出 蛋白质 NaCl浓度从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大 部分发生盐析沉淀 溶解 由上表可以看出，在NaCl为2 mol/L时，DNA溶解,而部分蛋白质发生盐析而生成沉淀，通过过滤可除去部分蛋白质；在NaCl为0.14 mol/L时，DNA析出，过滤可除去溶解的部分蛋白质。 2．实验操作过程 (1)材料的选择①首先选择含有DNA的生物材料。 ②选用DNA含量相对较高的生物组织，成功率较大。 (2)材料的制备(以动物鸡血材料为例)? (3)方法步骤 （见右） 特别提醒 进一步提取DNA时，可以用冷却的体积分数为95%的酒精溶液， 它主要有三个优点： ①抑制核酸水解酶的活性，防止DNA降解；②降低分子运动，易于形成沉淀析出；③低温可以增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。 【探规寻律】　(1)实验中三次过滤操作的比较 过滤次数 过滤目的 第一次 过滤核外物质，除去不溶的杂质 第二次 过滤除DNA外的其他核内物质，尤其是核蛋白 第三次 过滤DNA滤液 (2)提取DNA过程中，三次使用玻璃棒的方法不同: ①沿着同一方向快速搅拌，加速血细胞破裂，释放DNA。 ②搅拌含有悬浮物的溶液时，沿着同一方向缓慢搅拌，不能直插烧杯底部，防止打碎DNA分子。 ③沿着同一方向缓慢搅拌并轻轻旋转，以利于絮状物缠绕在玻璃棒上。 (3)第一次用到蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，提取核DNA；第二次用到蒸馏水的目的是稀释NaCl溶液，使DNA析出。 DNA的鉴定方法 项目 两支20 mL的试管 1号 2号 实验步骤 加入2 mol/L的NaCl溶液 5 mL 5 mL 加入丝状物(DNA) ? √ 用玻璃棒搅拌 ? 丝状物溶解 加入二苯胺试剂 4 mL 4 mL 沸水浴加热 5 min 5 min 观察现象 不变蓝 变蓝 特别提醒 实验现象不明显的原因 (1)材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水用量不够。 (2)加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。 (3)析出含DNA黏稠物时，蒸馏水沿着烧杯壁加入，可能一次加入太快。 (4)实验中多次使用玻璃棒搅拌，操作不当也会影响实验结果。 实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作： 试管序号 A B 1 加入物质的量浓度为2 mol/L