- 1、本文档共48页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
PCR引物及设计及相关软件使用
PCR引物设计及相关软件使用 主要内容 背景 PCR引物设计原则 常用PCR引物设计软件 Primer Premier 5.0 介绍 Oligo 6.22 介绍 在线Primer3 介绍 PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点;能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断;可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。 PCR 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很弱,等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页,得到设计好的引物,也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 引物设计的原则 引物与模板的序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 影响因素 如引物长度(primer length),产物长度(product length) 序列Tm 值(melting temperature) 引物与模板形成双链的稳定性(internal stability, 用?G 值反映),形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值 在错配位点(false priming site)的引发效率 引物及产物的GC 含量(composition),等等。 必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。 一般原则 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基,如GGG 或CCC,也会使错误引发机率增加。 一般原则 3.引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。 一般原则 4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。 一般原则 6. ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。 一般原则 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 一般原则 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 常用的引物设计软件 Oligo 6 (引物评价)* Premier Primer (自动搜索)* Vector NTI Suit Dnasis Omiga Dnastar Primer3 (在线服务)* Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析 简并引物设计 根据氨基酸序列来设计引物DNA引物 Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择 1、纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear) 2、无脊椎动物线粒体(Invertebrate Mitochondrion) 3、支原体(Mycoplasma) 4、植物线粒体(Plant Mitochondrion) 5、原生动物线粒体(Protozoan Mitochondrion) 6、一般标准(Standard) 7、脊椎动物线粒体(V
您可能关注的文档
- (2#墩)水下承台钢板桩围堰施工及设计方案.doc
- (东二村一建)沥青路面硬化工程施工组织及设计-中标.doc
- (东二村铭基)沥青路面硬化工程施工组织及设计.doc
- (川化)南充炼油化工总厂特种润滑油生产装置安全隐患整改工程施工组织及设计.doc
- (亿视)亚太中心智能化小区系统及设计方案(改加扫描).doc
- (广东省粮食局办公大楼7-8、10层装修改造工程)施工组织及设计.doc
- (开题报告)乔家栅甜品店及设计—蓬莱路店.doc
- (广州大学电气课程及设计)建筑供配电系统及设计说明书正文.docx
- (桃园村一建)农村硬化和亮化工程施工组织及设计-中标.doc
- (徐性怡)电动汽车用电机控制系统及设计方法与发展趋势介绍.doc
- 专卖店促销员销售与成交技巧培训课件(34P).pptx
- 红色商务风新员工入职销售技巧知识培训课件(34P).pptx
- 专卖店商场销售员销售与成交技巧培训课件(34P).pptx
- 小区物业保安法律知识培训课件(28P).pptx
- 专卖店销售员轻松成交技巧培训(34P).pptx
- 轻松成交客户新员工入职通用销售技巧知识培训(34P).pptx
- 2024年初级《银行业法律法规与综合能力》考前必刷必练题库500题(含真题、必会题).docx
- 2024年“新安法知多少”知识竞赛题库及答案(最新版).docx
- 2024年30秒毕业生面试工作自我介绍.docx
- 2024年《医务人员礼仪培训》心得体会.docx
文档评论(0)