常用液相色谱柱原理及使用与维护保养SOP-程睿.ppt

常用液相色谱柱使用与保养SOP 新药研发部 chengrui 2011.05 主要内容 1、液相色谱柱基本理论知识 2、常用液相色谱柱使用方法与维护保养 3、液相色谱柱常见问题分析与解决方案 4、结语 1、常用液相色谱柱基本理论知识 1.3.5常用液相色谱柱主要应用范围与特点汇总 1.3.5.1反相色谱柱 2、常用液相色谱柱使用方法与维护保养 (1)认识色谱柱规范化使用与保养的必要性：延长色谱柱使用寿命，降低色谱柱使用成本，逐步提高分析人员色谱柱使用与维护水平，确保试验数据的准确性、可靠性和重现性，提升个人在色谱领域的竞争力。 (2)熟悉几个概念： 液相色谱柱：指用于液相色谱分离的柱形固定相，由柱管、压帽/卡套、筛板（滤片）、填料、接头等组合而成，可用于液相色谱分析与制备。 色谱柱再生：指色谱柱在非正常情况下，针对异常现象及原因采取的一系列修复补救措施，以提高色谱柱柱效和延长其使用寿命的处理过程。 运载溶剂（Shipping Solvent）：指色谱柱生产厂商在柱出厂测试合格后饱和于色谱柱内的合适溶剂，以利于运输保存，多与保存溶剂相同。 保存条件（Storage Conditions）：指色谱柱生产厂商根据不同柱类型及其色谱柱填料的制备、键合、装填、高压定型、净化干燥等工艺条件的不同要求而特别制定的色谱柱保存前净化饱和的处理程序与储存条件，包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、保存温度。 保存溶剂（Storage Solvent）：用于保存色谱柱并指定了溶剂组成与 比例的溶液。 （4）连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗4h以上。（目的是充饱和色谱柱，去除柱内空气）（5）用水-有机相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速冲洗2h以上[或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3～0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂，以0.3～0.6ml/min流速冲洗1h以上→最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。（目的是老化色谱柱）（6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡，必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。 （4）最好再确保连接好保护柱（多使用相应柱制造商针对性提供的保护柱），再用选用的洗脱液以0.6ml/min流速平衡1h以上，进样检测。同样，若洗脱液中含有缓冲盐类，在用分析洗脱液平衡之前，先用不含缓冲盐的同比例洗脱液过渡，冲洗约10倍柱体积，避免缓冲盐在分析柱内析出。（5）特别提示：①洗脱液要求是新制的低电导率缓冲液，或者是有UV吸收的缓冲液。对于阳离子交换柱，多用柠檬酸或酒石酸缓冲液（或其混合溶液）、邻苯二甲酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5；对于阴离子交换柱，多用磷酸缓冲液、硝酸铵溶液（1mMol/L），邻苯二甲酸缓冲液，pH范围从2.5到6.5。绝对禁止使用水杨酸缓冲液，因水杨酸分解产物会改变固定相的性质。洗脱液在使用以前必须用0.45微米滤膜过滤并彻底脱气，以防止发生检测和泵送问题。②提倡在室温环境使用，为了提高分析的稳定性，可以设置高于室温5～ 10℃的柱温，最好不要在40℃以上使用。 ④以上（1）～（6）是在反相条件下使用情况，如果要换成正相使用，必需先用100%异丙醇以0.5ml/min流速冲洗约30min过渡，其他要求同上。 ⑤色谱柱保存时，必需保证柱内无缓冲盐或其他盐类物质残存。 ⑥手性柱在使用过多次且正常后，可简化上述程序，将时间适当缩短即可。 （8）特别建议： ①当分离分析酸碱性手性化合物时，有必要在流动相加入少量电荷迁移添加剂（浓度不超过10mMol/L）来提高手性柱的手性选择性。常见的有：分离酸性化合物时，添加酸性添加剂[如三氟乙酸(TFA) 、乙酸(Acetic acid) 、甲酸(Methanoic acid)、七氟乙酸（HFBA）、辛酸（OA）]，浓度0.01%～0.5%；分离碱性化合物时，添加碱性添加剂[如二乙胺(DAE) 、三乙胺（TAE）、丁胺(Butyl amine，BAE) 、乙醇胺(Ethanol amine，EthAE)、N，N-二甲胺（DMOA）]，浓度0.01%～0.5%。 ②辛酸（OA）及N，N-二甲胺（DMOA）与水的互溶性有限，在常温下，仅仅2mMol/L（OA）或5