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讨论 抗癌活性肽(anti—cancer bioactive peptide，ACBP)来源于经过诱导动物脏器，以现代生物技术分离、提取的一种新型抗癌生物制剂[19]。在将近十年多的研究中，目前已经完成了对小白鼠及大白鼠进行的急毒和长毒试验，表明ACBP对正常的生理过程及酶的代谢基本上没有干扰，未发现明显的毒副作用。 * 论文答辩 欢迎各位老师指导 dthv提供：拓展培训 抗癌活性肽对大肠癌LOVO细胞及相关凋亡基因的影响 学 科 专 业：外科学 导 师 姓 名：王茂春 教授 指 导 教 师: 苏秀兰 教授 研 究 生 姓 名：白斯古楞 前言 大肠癌为人类常见的恶性肿瘤之一，病死率极高。在我国的发病率有大幅度提高，病死率也不断上升，已经位居恶性肿瘤死亡率的第4～5位[3,4] 。目前大肠癌的治疗还是以手术治疗为主，但即使结直肠癌病人接受了根治性手术，复发率仍较高，而再次手术的机会又很小[5]。大肠癌的高发病率与相对低存活率表明对其需要一种更有效的治疗策略，需要积极探索大肠癌生物治疗的新方法，以提高患者的生存质量，延长生命，为全身治疗创造条件。 抗癌活性肽（Anticancer bioactive peptide，ACBP)是一种天然活性物质,相对分子质量小于800kd，属于小分子多肽[13,14,15] 。具有抑制肿瘤细胞增殖和激活免疫系统的双重作用，大量体外细胞实验和动物体内试验证明，ACBP能够抑制胃癌，卵巢癌，鼻咽癌，胆囊癌等多种肿瘤细胞的DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡和分化，降低肿瘤患者血液粘稠度，改善微循环，调节患癌机体无氧糖酵解，提高机体免疫力。 P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高，研究最广泛、深入的基因之一。p53分为野生型(wild-type p53,wtp53)和突变型(mutant-type p53,mtp53）[7] 。野生型p53 对细胞的分裂和增殖起负调控作用，是抑癌基因。而p53蛋白由于不稳定，易发生突变，一旦p53发生突变，就会丧失野生型p53 基因所具有的细胞周期停滞、诱导凋亡发生、介导细胞衰老、维持基因稳定和错配基因修饰等抑癌功能，同时获得许多癌基因的特殊功能。 Bcl-2基因家族分为两大类：一类是抗凋亡蛋白，另一类是促凋亡蛋白[8]。bcl-2、Bcl-xl属于Bcl-2基因家族成员中抗凋亡蛋白一类。bcl-2基因能抑制细胞凋亡而延长细胞的寿命，但不能促进细胞增殖，即细胞凋亡抑制基因。 实验路线图 体外培养大肠癌lovo细胞 分为NS、5-FU、 ILP三组 倒置显微镜下观察细胞凋亡 RT--PCR方法检测 p53、Bcl-2 、Bcl-xl 基因的表达 得出结论 统计学处理 取3-4代的细胞 作用24h 实验方法 体外培养人体大肠癌lovo细胞株 实验分组：将大肠癌lovo细胞株常规复苏,放入在37℃、5% CO2,饱和湿度的培养箱中培养。24小时更换DMEM培养基一次,待细胞融合时用0.25%胰蛋白酶消化传代,取3-4代的细胞，分别加入生理盐水( 0.5mL，对照组)、5-FU ( 0.5mL，阴性对照组) 、抗癌活性肽( 0.5mL，用药组) 用药24h后倒置显微镜下观察各组lovo细胞形态学改变。 收集细胞加入1ml的Trizol 提取总RNA 细胞总RNA鉴定：1％的琼脂糖电泳来鉴定细胞总RNA，观察出现的各个条带及条带亮度。 总RNA提取步骤： 收集细胞，加入1ml的Trizol 室温静置5min 加入氯仿0.2ml/管 室温静置5min 上清液转至新离心管 漩涡振荡30s后离心 弃上清，加入1ml75%乙醇洗涤 室温静置10min 弃上清，保留沉淀 溶解于适量的DEPC水中 冰上放置5min 12000g，4℃，离心5min 剧烈震荡混匀 一般500ml洗两次 12000g，4℃，离心5min 12000g，4℃，离心5min 12000g，4℃，离心5min 12000g，4℃，离心3min室温晾干 加入等体积异丙醇，上下颠倒 DU800紫外分光光度计测定：分别测定细胞的总RNA光密度值(OD)在260nm和280nm处的,并计算RNA的含量和纯度。要求RNAOD260/OD280值在1.5-2.0之间，浓度在500ug/ml以上的符合实验条件。 RT-PCR半定量方法检测抗癌活性肽（ACBP）对大肠癌lovo细胞p53、bcl-2、Bcl-xl基因表达的影响。 RT反应液配置 试剂 使用量 5×PrimeScript?Buffer 4 μl PrimeScript?RT Enzyme Mix I 1 μl