高效液相色谱与液相色谱-质谱分析冬虫夏草相关产品之麦角固醇与其衍生物.docVIP

高效液相色谱与液相色谱-质谱分析冬虫夏草相关产品之麦角固醇与其衍生物 　　摘 要 采用HPLC与LC-MS分析西藏冬虫夏草（Cordyceps sinensis, Cs）子实体、Cs分离的无性世代中国被毛孢（Hirsutella sinensis）菌丝体（Hsm）RS6-3、市售蛹虫草（Cordyceps militaris, Cm）和蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali, Cs-4）中所含的麦角固醇与其衍生物。结果表明: Cs子实体子座的麦角固醇比菌核高约3倍，含量约为0.92 g/L，且该子座含2种H1-A衍生物；本实验室所分离的Hsm RS6-3含有5种H1-A衍生物；但Cs子实体菌核、Cm和Cs-4均不含有H1-A衍生物。本研究为虫草相关产品的质量检测提供了技术支持。 　　关键词 冬虫夏草； 中国被毛孢； 蛹虫草； 蝙蝠蛾拟青霉； 麦角固醇衍生物; 高效液相色谱; 液相色谱-质谱 　　 　　1 引 言?? 　　冬虫夏草（Cordyceps sinensis （Berk.） Sacc.，Cs），由僵硬的喜马拉雅鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫虫草的蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus Oberthur）幼虫的头顶长出菌柄（Stipe）和子座（Stroma），最终形成一个狼牙棒的子实体 。本实验室于1999年从Cs子实体中分离出来无性世代中国被毛孢菌丝体（Hirsutella sinensis mycelium, Hsm），并获分子生物鉴定其基因而确认。?? 　　Cs因可治疗肺与肾脏等疾病而受到关注。麦角固醇（ergosterols）及其衍生物具有细胞毒素活性、抗病毒与抗心律不整等药理功效，而Cs特有的麦角固醇衍生物H1-A甚至可抑制已活化的人类肾丝球肾膈细胞（Activated human mesangial cells）及改善A型免疫球蛋白肾病（Immunoglobulin A nephropathy）。?? 　　本研究采用HPLC分析西藏的Cs子实体分离的Hsm RS6-3、市售蛹虫草（Cordyceps militaris， Cm）和蝙蝠蛾拟青霉（Paecilomyces hepiali， Cs-4），对甲醇提取液中二次代谢产物进行层析图谱分析，探讨其LC-MS/MS的分析条件，寻找虫草甲醇提取液中麦角固醇及其衍生物H1-A相关二次代谢产物，为虫草相关产品的质量检测提供技术支持。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器、试剂与材料?? 　　 　　Cs子实体（西藏）；Cm（台湾万生生技公司）与Cs-4菌丝体粉末（烟台瑞东科技发展公司）；马铃薯葡萄糖肉汁培养液（PDB）及其洋菜培养基（PDA）购自美国Acumedia公司；蛋白胨（美国Difco公司）。麦角固醇标准品（美国Sigma公司）；甲醇（HPLC级，德国Merck公司）；实验用水均经过Milli-Q的纯水系统（美国Millipore公司）处理。 　　2.2 菌株的培养与保存?? 　　本研究室从Cs子实体中分离出无性世代菌株Hsm RS6-3，接种于PDA的斜面试管中，以（15±0.5）℃进行种菌培养，每隔4～6个月移殖至新鲜PDA斜面试管中培养，以此进行菌种的培养与保存。 　　2.3 实验用菌株的培养准备?? 　　以无菌接种钩勾取面积约0.5～1 cm2的菌丝体，移植到含有PDA的平板中，并于（15±0.5）℃培养2个月，再以无菌接种钩勾取面积约0.5～1 cm2的菌丝体，移植到含有150 mL PDB的500 mL摇瓶中，在转速80 r/min，（15±0.5） ℃条件下。摇瓶振荡培养2个月。 　　2.4 HPLC的分析条件?? 　　L-2130 HTA型HPLC系统，配L-2420型UV-visible检测器（日本Hitachi公司）；Thermo C-18 Gold色谱柱（250 mm×4.6 mm i.d., 5 　　 m, 澳大利亚Thermo公司）；柱温40 ℃；进样量为20 　　 L；流动相为甲醇-水（9∶1， V/V）；采等度洗脱方式；流速0.67 mL/min；检测波长280 nm。 　　2.5 样品的前处理?? 　　将Cs子实体切割分成子座（Stroma）与菌核（Sclerotium）两部份，并冻干以备使用；培养2个月的Hsm RS6-3，在4 ℃，以6000 r/min离心15 min，获取其菌丝体部份，以超纯水清洗两次并冻干，备用；Cm与Cs-4菌丝体的粉末亦于使用前冻干。 　　2.6 HPLC分析样品的总麦角固醇?? 　　在0.1 g经干燥并研磨成粉末的样品中，加入10倍体积的甲醇，并于冰浴中超声振荡10 min；以10000 r/min离心5 min，收集上清液；其沉淀物再加