第6章同位素示踪在植物病理学研究中的应术方案培训.pptVIP

第16章.示踪技术在植物病理学研究中的应用 中国农业大学 齐孟文 第16章.示踪技术在植物病理学研究中的应用 §1 病原微生物的标记 1.1直接法 通过标记培养基而标记病原微生物的方法。将适合的放射性核素或其标记化合物,加入培养基,然后接种病原微生物, 通过培养使其摄取放射性而获得标记,该法仅限于非专性寄生微生物的标记。 方法要点 培养基 适合的普通培养基。 标记核素 常用14C、32P、35S，如14C-葡萄糖，14C-蔗糖， 32P -KH2PO4。 放射性活度 MBq/ml的范围 为了避免刮取菌落时被放射性培养基粘污可用双层培养法。 平板培养时，先在含放射性的培养基上接种培养，待菌落铺满后，再在上面铺上一层非放射性培养基，经过一段时间，菌絲将透过上层培养基，这样获得的标记菌落，可避免放射性培养基污染。 1.2 间接法 对专性寄生菌，如锈菌，白粉菌，病毒等应 先标记寄主，通过寄生关系使病原微生物得到标 记。 1）寄主植物 先标记后接种，用一般植物标记 法进行标记，干组织应具有0.37 ?104 3.7 ?104 Bq/ml。 2）寄主真菌 如以真菌为食料的线虫体,先培养 并标记交链孢霉菌,取得标记的孢霉菌后,在其体上接种线虫体进行标记。 3）寄主细菌 通过标记细菌使其专性寄生噬菌体得到标记。先标记细菌， 洗去放射性粘污，配成放射性菌液，然后接种噬菌斑，经培养止混浊悬浮液变清，表明细菌已几乎被吞食，用细菌过滤器过滤，可获得纯的标记噬菌体。 1.3标记检测 制备的标记病原微生物可用于病原微生物与寄主间相互关系、病害侵染规律、致病机理等方面研究。在应用前要洗净表面的放射性粘污和测定其浓度或比活度。 1）洗涤 一般采用徒手振荡，减压抽滤或离心洗涤法，洗至下洗液无明显放射性或接近本底为止。 2）测定 32P标记的真菌，可用固型闪烁倍杯法测量，14C-标记的真菌、线虫、细菌等病原生物，可取其悬浮液，用液闪测量，感病生物的患病部位，可用相应制样法制备样品并测量。 § 2 病害侵染途经的研究 探明病害的侵染途经可为制定防冶措施提供依据。通过一定方法接种病菌后，定时对客体进行空间取样检测或进行自显影，便可确定病菌的侵染途经、过程及规律。 2.1 土壤病害侵染途经 土传病害，主要由真菌或线虫引起。进行研究时，病原微生物常用直接拌土壤法,或制成菌液或孢子悬浮液浇灌植株周围土壤的方法引进,使其繁殖达到侵染的目的,然后定期对植珠取样进行放射测定或自显影,判明示踪菌的侵染途经及其在寄主中的分布。 3.1检测的一般程序 ? 1）试剂制备 培养病原菌 免疫 标记 普通 杂交瘤 标记抗原 多克隆抗体 单克隆抗体 （PcAb） (McAb) 标记 标记抗体 2)样品制备 植物试样经匀浆或液氮冷冻研磨用缓冲液提取，上清液用于测试。 3)测试程序 测定可采用基于饱和竞争结合的放射免疫（RIA)或免疫放射分析。 固相载体（聚乙烯） 包被抗体（包被液） (V.T.t） 拍干洗涤（洗涤液） 封板（封闭液） 加入样品或标准+抗原*（反应液） 温浴 （T.t） 洗涤 （洗涤液） 测量B ，B/B。=f(Ag):Ag=f-1 ( B/B。)。 3.2应用举例 序号 检测对象 方法 作者 年代 1 水稻白叶枯病菌 RIA 董以德 1981 2 水稻矮缩病毒 IRMA 金子渔 1986 3 水稻细菌性条斑病 125I-A蛋白 王公金 1990 4 小麦花叶病毒 ELISA 刘常宏 1995 5 棉铃虫核多角体病毒 ELISA 陆字融 1995 6 香蕉束顶病毒 ELISA 范国成 1999 7 玉米种子携带的MDMV ELISA 马占鸿 1997 8 葡萄扇叶病毒 ELISA 谷洪包 1994 §4病理学研究的相关技术 阐明病源微生物与寄