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家蚕核型多角体病毒GD株空斑克隆株系的建立 　　摘要：以家蚕胚胎细胞系(Bm E-swUl)为病毒培养栽体。利用中性红染色的方法对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)GD株进行了空斑克隆，经扩大培养，获得了CD株空斑克隆株系。根据Bm NPV c01株基因组序列的单核苷酸多态性(SNP)分析，选出其中SNP位点较多的gcn2(General eontrol nondere-pressible 2)基因，用于验证Bm NPv GD株空斑克隆株系的纯粹性。分别从Bm NPV GD株和空斑克隆株的基因组中扩增gcn2基因，经pMD18-T克隆后测序；将两株病毒的gcn2基因分别进行SNP位点分析。发现GD株grn2基因的潜在SNP位点有2个，而空斑克隆后的病毒株5条gcn2基因序列比较后均未发现多态性位点，说明空斑克隆株经纯化后，病原基因组的纯粹性获得了提高，病原得到了纯化。 　　关键词：家蚕核型多角体病毒；空斑克隆；SNP住点：纯粹性 　　中图分类号：S884.5+1；Q785　文献标识码：A　文章编号：0439-8114(2010)04-0785-03 　　 　　家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleo-polyhedrovirlls，Bm NPV)属于杆状病毒科，是在昆虫病毒病中发现最早的一类病毒。家蚕受此病毒侵染后，于病程的后期流出脓汁，俗称血脓病。长期以来，学者们致力于从基因、细胞水平研究病毒致病机理，期待彻底解决家蚕核型多角体病毒对养蚕业的影响。采用细胞空斑纯化方法获得遗传上均一的病毒株系，可保证分子生物学试验的准确性和惟一性，是深入探讨病毒遗传学和分子生物学特征的基础。家蚕核型多角体病毒分布广泛，不同株系的基因结构具有明显差异，通过比较NCBI数据库中BmNPV T3株和SC7株的序列得知。不同地区的BmNPV基因组序列存在一定的差异，齐义鹏等的研究发现，Bm NPV中国株和日本株的uy39基因差异较大；作者的前期研究也证实了不同株系BmNPV bro基因家族的构成差异显著；由此可知，该病毒变异性较大。为保证其基因组学研究的准确性，本文以Bm NPV广东分离株(GD株)为材料，进行了空斑克隆，以获得纯化的病毒株；通过对BmNPV重庆株(CQ1株)基因组进行单核苷酸多态性(SNP)分析，选出SNP位点较多的gcn2基因用于验证Bm NPV GD株空斑克隆株的病原纯粹性，即调查空斑克隆前与克隆后的病毒株中，这个基因的潜在SNP位点的变化情况。现将结果报告如下。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1　材料 　　1.1.1　Bm NPV病毒株与宿主细胞Bm NPV广东株(GD株)由华南农业大学蚕病实验室馈赠：家蚕胚胎细胞系(Bm E-SWUl细胞)由西南大学蚕学与系统生物学研究所细胞实验室建立。 　　1.1.2试剂 　　Grace昆虫细胞培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自PAA公司；细胞培养板购自Corn.ing公司；PCR产物回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司：克隆载体pMDl8-T购自TaKaRa公司；低熔点琼脂糖、工具酶购自Promega公司。 　　1.1.3 PCR引物gcn2上游引物：5’-q’TCTGCCCATAGCGAGTG-3’；gcn2下游引物：5’-GACAACGCAGCATAGGGA-3’：由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1 Bm NPV空斑克隆方法接种Bm E-SWUl细胞于6孔细胞培养板中，待细胞均匀贴壁后。吸除培养基，加入病毒液，28℃吸附1 h后，吸除病毒液，加入含1％低熔点琼脂糖和20％血清的培养基，封好培养板。28℃培养2-3 d。加入中性红染液，28℃培养2-3 h，然后吸除染液，倒置细胞板，黑暗过夜，以使空斑显现。空斑显现后，挑出空斑，于培养基中培养1 h以上。4000 r／min离心10min，上清作为下一轮空斑纯化的原液。经过4-6轮的空斑纯化，可形成Bm NPV GD株空斑克隆株系。 　　1.2.2 Bm NPV基因组的提取采用碱裂解法进行提取。 　　 　　 　　1.2.3 PCR反应PCR反应体系为25μL，在Ep-oendorf仪上进行PCR反应，反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s.53℃退火1 min，72℃延伸2min.30个循环；72℃延伸10 min，4cC保存。 　　1.2.4单核苷酸多态性分析 　　氨基酸序列翻译采用BioXM2.0软件进行处理，序列比对分析采用ClustalXl.83软件进行。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2.1　Bm NPV GD株空斑克隆株系的建立 　　利用中性红染色的方法进行空斑纯化，活细胞着