2012免疫组化课件PPT.pptVIP

免疫组（织）化（学）原理及相关要点; 一 免疫组织（细胞）化学的概念; 应用 凡是组织细胞内具有抗原性的物质（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均可用免疫组织化学方法显示而进行定性、定位分析或定量研究，进而深入研究其功能。 解决三大问题： 有没有？ 在哪里？ 多与少？ ; 特点 优点 特异性强，定位准； 结果直观； 形态学改变与功能和代谢相结合； 组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。 缺点 步骤多，影响实验成败的因素多； 以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量 分析尚需标准化。 ; 二 免疫组化技术的基本步骤 1.制片 组织切片(石蜡切片、冰冻切片) 细胞爬片 组织印片 血液涂片 2.抗原抗体反应＋标记物的显色（反应） 3.指标检测分析 采集图像＋数据测量＋结果分析 ; 三 免疫组化的分类 （1）根据标记物的性质 ;① 酶 原理：基于酶与底物发生反应并产生不溶性有色产物。 特点：不需要特殊的显微镜； 染色后的标本可长期保存； 可以进行复染，使形态更明确； 可根据酶和底物的不同而显示不同的颜 色，易进行双重或多重染色。 ; 常用酶 辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP) 底物：DAB(四盐酸二氨基联苯胺)，产物为棕褐色。 碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP） 底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。 葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD） 底物：葡萄糖，产物为蓝色。 注意：DAB有潜在的致突变作用;② 荧光素 原理：吸收特定范围波长的光而激发其自身发出另一范围波长（颜色）的光。 特点：需要荧光显微镜观察结果； 标本不能长期保存； 敏感性高，背景低； 标本可以用多种荧光素标记。 ; 常用荧光素 异硫氰酸荧光素 (fluoresceinisothiocyanate, FITC)，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈明亮的黄绿色。 四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200），最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈橘红色。 藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE），最大吸收波长约490nm，最大发射约为677nm，呈红色。;(2) 按抗体、抗原与标记物的作用方式 ①直接法： 特异性抗体（一抗）与抗原结合； 标记物直接连接在一抗上。 ;特点： 方法简单、省时，专一性强； 非特异染色轻； 敏感性差； 一种标记抗体只能检测一种抗 原。;②间接法 一抗与待检测的抗原结合； 二抗与一抗结合（一抗作为二抗的抗原）； 标记物连接在二抗上。;特点： 敏感性高； 一种标记抗体（二抗）能用于同一中物种中多种抗原的检测； 样本1：兔（VEGF） 样本2：人（P53） 一抗：小鼠抗兔（IgG） 一抗：小鼠抗人（IgG) 二抗：HRP标记山羊*抗*小鼠IgG 费时，非特异染色稍重。 ; 四 抗体的选择及保存和反应条件 （1）抗体的种属来源（宿主） 样本，一抗，二抗来自于不同种属 样本：大鼠 样本：人 一抗：兔 一抗：小鼠 二抗：山羊 二抗：兔 （2）反应特异性 该抗体适合检测哪些种属动物体内的抗 原，不同种属间可能存在反应差异。 ;（3）类型 单克隆抗体(小鼠来源),多克隆抗体。 （4）应用范围 IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr), 甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位 亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。;;（7）抗体的保存与孵育条件 ①保存的条件 一抗：用前分装，－2