6 第六章 免疫胶体金银技术PPT.pptVIP

第六章 免疫金银及铁标记技术; 免疫金技术发展简史;免疫胶体金银技术 ;一、免疫金技术 胶体金：金的水溶液，具有一般溶胶特性。 胶体金制备：化学还原法；在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂使金离子变成金原子（氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态）。 胶体金颜色：用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。 5-20nm 葡萄酒红 20-40nm 深红色 60nm 橙黄色 还原剂：白磷、乙醇、过氧化氢、枸橼酸钠、鞣酸等 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金颗粒与蛋白质因静电吸附而形成牢固结合。此外，还可与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合。;(2)试剂 容器: 酸处理洗净 配制试剂: 双蒸馏水或三蒸馏水 氯化金水溶液的配制：1g的氯化金溶解于双蒸水中配成l％的水溶液；4℃冰箱内保存。 白磷配制：在双蒸水中切块，吸干水分；放入乙醚至溶解，棕色瓶密闭保存 ;(2)柠檬酸钠—鞣酸还原法 特点：通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金， 且颗粒的直径均匀一致，适合于双标及多标研究。 ;制备胶体金时都应注意以下各点： ① 所有溶液均应用双蒸水配制 ② 柠檬酸钠与鞣酸溶液应现用现配 ③ 用于制备胶体金的烧瓶硅化需处理 ④ 在清洁干燥的烧瓶中加入少许1％硅油，轻轻转动烧瓶， 使硅油均匀铺展于烧瓶内壁，倾出多余硅油。 烧瓶置烤箱内烘干。 上述步骤可重复2～3次 ;3 蛋白质的胶体金标记;（1）待标记蛋白质准备; （3）蛋白质的胶体金标记 （1）根据标记胶体金的总量计算所需待标记蛋白质的总量。 （2）在电磁搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中（pH已调至PI超过0.5pH），逐滴加入蛋白质，1mg的蛋白质大约5min加完。; （4） 胶体金标记蛋白质的纯化 目的：除去未标记蛋白、未标价胶体金、聚合物。 方法：高速与超速离心法、凝胶过滤法 1）高速与超速离心法 1）将标记的大于10nm的胶体金溶液高速离心机离心15min，吸上清，弃沉淀，去除大的聚合物。; 2) 凝胶过滤法 特点： 简便，颗粒比较均匀， 不易凝集，克服了离心 方法胶体金颗粒易凝集 的弱点。必须用牛血清 白蛋白作稳定剂。 操作过程： 1）浓缩的胶体金离心取上清 2）加样体积为柱状体积的1/10 3) 丙烯葡萄糖S-400装柱，TBS平 衡层析柱 4）TBS洗脱，注意颜色变化。 ;（5） 免疫金染色法 1978年，首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的免疫金法（IGS）。 特点： 染色程序简便，不要显色; 能检测细胞表面和细胞内抗原。 要求: 金颗粒的直径大于20nm，且浓度较高。 一般都采用间接法。;（1）石蜡切片→脱蜡至水。 （2）胰蛋白酶消化或尿素消化。 （3）用双蒸水振洗5＇×2。 （4）用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。 （5）1% 卵蛋白（EA）封闭10min。 （6）稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体（TBS ），4℃过夜。 （7）0.02mol/l TBSpH8.2振洗10＇×2。 （8）1% EA封闭10min。 ; (6) 蛋白A-金（PAG）放大法 在IGS方法定位细胞抗原时可用搭桥法，使IGS得到放大. 抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法(以5-羟色胺定位为例): （1）石蜡切片→脱蜡至水。 （2）胰蛋白酶消化或尿素消化。 （3）TBS洗5＇×2。 （4）1% EA封闭组织。 （5）用TBS 稀释兔抗5-羟色胺抗体,4℃过夜，或者37℃1h。 （6）TBS振洗5＇×2。;（7）1% EA封闭10min。 （8）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释PAG. （9）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。 （10）1% EA封闭10min。 （11）抗A蛋白抗体（1：100）37℃45min。 （12）0.05mol/l pH7.4 tbs振洗10‘×2。 （13）加0.05mol/l pH7.4 TBS稀释PAG（1：40）。 （14）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。 （15）双蒸水振洗5min。 （16）1%戊二醛10min。 （17）双蒸水振洗5min。 （18）0.01% 伊文思蓝2min，甘油封片。;结果：光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，