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液相色譜法 色譜法也叫層析法，它是一種高效能的物理分離技術，將它用於分析化學並配合適當的檢測手段，就成為色譜分析法。 色譜分離基本原理： 在色譜法中存在兩相，一相是固定不動的，我們把它叫做固定相；另一相則不斷流過固定相，我們把它叫做流動相。 色譜法的分離原理就是利用待分離的各種物質在兩相中的分配係數、吸附能力等親和能力的不同來進行分離的。 使用外力使含有樣品的流動相（氣體、液體）通過一固定於柱中或平板上、與流動相互不相溶的固定相表面。當流動相中攜帶的混合物流經固定相時，混合物中的各組分與固定相發生相互作用。 由於混合物中各組分在性質和結構上的差異，與固定相之間產生的作用力的大小、強弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經過反復多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時間不同，從而按一定次序由固定相中先後流出。與適當的柱後檢測方法結合，實現混合物中各組分的分離與檢測。 色譜分類方法： 色譜法中，流動相可以是氣體，也可以是液體，由此可分為氣相色譜法（GC）和液相色譜法（LC）.這裡主要介紹液相色譜法. 液相色譜法是指流動相為液體的技術。早期的液相色譜（經典液相色譜）是將小體積的試液注入色譜柱上部，然後用洗脫液（流動相）洗脫。這種經典色譜法，流動相依靠自身的重力穿過色譜柱，柱效差(固定相顆粒不能太小)，分離時間很長。? 70年代初期發展起來的高效液相色譜法，克服了經典液相色譜法柱效低，分離時間很長的缺點。成為一種高效、快速的分離技術。高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9×107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高於經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱後連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。 特點 高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少於 1h 。 高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。 高靈敏度：高效液相色譜已廣泛採用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如螢光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。 適應範圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難於應用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能製成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對於高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大於 400 以上）的有機物（這些物質幾乎佔有機物總數的 75% ～ 80% ）原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離、分析。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。 高效液相色譜儀: 高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。 一.高壓泵HPLC使用的色譜柱是很細的（1~6 mm），所用固定相的粒度也非常小（幾μm到幾十μm），所以流動相在柱中流動受到的阻力很大，在常壓下，流動相流速十分緩慢，柱效低且費時。為了達到快速、高效分離，必須給流動相施加很大的壓力，以加快其在柱中的流動速度。為此，須用高壓泵進行高壓輸液。高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。 ???HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件： ???a. 流量恒定，無脈動，並有較大的調節範圍（一般為1~10 mL/min）； b. 能抗溶劑腐蝕； c. 有較高的輸液壓力；對一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對高效分離，要求達到150~300×105Pa。 (1). 往復式柱塞泵 當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點是不受整個色譜體系中其餘部分阻力稍有變化的影響，連續供給恒定體積的流動相。 (2). 氣動放大泵 其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積（ SA ）活塞 A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數取決於 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體。這是一種恒壓