总RNA提取--常用方案.docxVIP

试剂盒快速提取实验方法原理GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ，则根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。实验材料微生物动物细胞植物组织试剂、试剂盒RNA 提取试剂盒焦碳酸二乙酯乙醇仪器、耗材恒温水浴冷冻高速离心机紫外分光光度计取液器电泳仪电泳槽实验步骤一、细胞或组织破碎?1. ?微生物材料?（1）发酵3~4天（或对数生长期）的菌体，离心收集菌丝体（动植物材料无需此步处理）。?（2）用经DEPC处理的水洗菌丝体2~3次，并尽量除去残存的水。?（3）加液氮充分研磨，使其成为粉末，以释放RNA。?（4）研磨后的样品转移至12 ml 变性液的容器中匀浆。?2. ?动植物细胞培养材料 （适用的样品量为细胞：108）?（1）细胞或组织培养：按常规方法进行。?（2）深层悬浮培养细胞的破碎。?①细胞收集：含一定浓度的细胞培养液置于无菌离心管中，4℃，3 000 g 离心5分钟。?②细胞洗涤：上步沉淀用25 ml 灭菌后冰冻的1×PBS缓冲液洗涤，然后4℃，3 000 g 离心5分钟。?③细胞破碎：在沉淀细胞中加入15 ml 预冷的变性液，用无菌处理过的匀浆器匀浆。?3. ?表面培养细胞的破碎?（1）确定培养瓶数量，使选定的各培养瓶细胞累加后总量达108。?（2）细胞收集：将培养液倒掉，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤一次，在培养瓶中加入8 ml 预冷变性液。（3）转动培养瓶，使细胞溶解，此时可见粘度加大。?（4）用无菌吸管将第一个培养瓶中的液体吸入第二个培养瓶，旋转，溶解细胞，再吸入第三个培养瓶，以此类推。（5）直到将所选定的培养瓶全部洗涤一次，然后从第一个培养瓶开始再加入4毫升上述变性液，将所有培养瓶洗一次。?（6）将上述12 ml 含细胞的变性液转移至一50 ml 无菌离心管中，匀浆破碎细胞。?4. ?植物组织破碎 （适用的样品量为0.05 g 组织）?（1）将600 ul 变性液置于1.5 ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。?（2）将0.05 g 新鲜组织用液氮冰冻。?（3）在液氮下，研磨组织块。?（4）待液氮挥发后，将上述分散的组织转移至无菌离心管中。?5. ?动物组织破碎 （适用的样品量为1 g 组织）?（1）将12?ml 变性液置于50?ml 离心管中，将此离心管放于冰浴中5分钟。?（2）在上述管中加入1 g 新鲜或冰冻动物组织，匀浆粉碎。?二、RNA 的抽提?1. ?在经变性液匀浆的细胞或组织600 ul+60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。?2. ?600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。?3. ?冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。?4. ?上层水相吸至无菌离心管中加等体积的异丙醇，-70℃，30分钟沉淀RNA。?5. ?离心4℃，10 000 g，20分钟。?6. ?沉淀RNA ，冷冻干燥15分钟 ， RNA 沉淀重新溶于300 ul 变性液中，可振荡（有时为了帮助溶解，可在65℃加热，但时间应极短）。?7. ?60 ul pH4.0的2 M 乙酸钠彻底混匀，可用漩涡振荡器。?8. ?600 ul 酚\氯仿\异戊醇（25\24\1），彻底混匀或漩涡振荡器振荡10秒。?9. ?冰裕中10~15分钟，离心，4℃，10 000 g，20分钟。?10. ?上层水相吸至无菌离心管中。?11. ?等体积异丙醇二次沉淀（-70℃，30分钟），75%乙醇洗沉淀，沉淀冷冻干燥。12. ?复溶于去RNA 酶的水中（对于准备长期保存的RNA 可加入pH 5.0的乙酸钠至终浓度为0.25 M，再加入2.5体积的乙醇，-70℃保存。）。展开?注意事项1. ?研磨组织块用于RNA 提取的样品，必须是新鲜的细胞或组织，如采样后，不能立即用于提取则样品应用液氮速冻并贮于-70℃的冰箱中保存。2. ?变性液及相应的离心管需预冷。其他1. ?变性液组成25 g异硫氰酸胍溶于33 ml CSB(42 mM pH4.0乙酸钠、0.83%十二烷基肌氨酸钠、0.2 mM β-巯基乙醇)，65℃溶解，过滤灭菌，4℃预冷。?2. ?酸性酚配制55℃时，500 g酚溶入500 ml 50 mM，pH4.0乙酸