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* * 细胞培养技术 细胞培养的基本概念 细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留一定的结构和功能特性。 细胞培养实验的基本要求 1.实验前准备 准备好实验所需仪器、器材、细胞常用液、血清等。 2.无菌室和操作野消毒 3.无菌操作要求 4.实验中操作要求 5.实验后要求 常用仪器设备 超净台 三蒸水蒸馏器 CO2 培养箱 液氮罐 37℃ 水浴 倒置显微镜 离心机 冰箱 负压吸引器 细胞培养用液 包括平衡盐溶液、培养基、及消化液等 配制要求: 使用高纯化的三蒸水 按照用液的配方计算所需各成分的用量，然后准确量取，并按规定顺序溶于三蒸水中 保证各组分完全溶解 进行pH测试和调整 消毒分装小瓶，抽样做无菌实验 细胞培养用液 蒸馏水 平衡盐溶液（BSS）（PBS、Hanks、D-Hanks、Earle、Ringer、Dulbecco） 天然培养基（血清、水解乳蛋白、鼠尾胶原、胚胎浸液） 合成培养基 血清细胞培养基 无血清细胞培养基 消化液（胰蛋白酶液、EDTA、胶原蛋白酶液） 200mmol/L L-谷氨酰胺 抗菌素液（青霉素、链霉素液，卡那霉素，制霉菌素液） 血清使用注意事项 观察血清融化后的颜色和亮度，若颜色偏红，或色浅，或出现沉淀，表示血清质差或变质 血清冻融后最上层无色透明，活力最差，分装前应将其摇匀 血清反复冻融使用，其效价下降又容易污染 长时间冻存的血清，一旦冻融后出现沉淀物（此物抑制生长），应弃去 购买不同批号少量血清，进行细胞生长曲线、细胞克隆率检查，选出最佳血清 尽可能使用同一批号血清 血清灭活（灭活后可能丢失某些成分，但性质稳定，便于使用和保存） 合成培养基成分 氨基酸 注意：用于培养上皮细胞、内皮细胞、神经细胞等的培养基需补充谷氨酰胺碳水化合物 无机离子 维生素 其它成分 如核酸降解物如嘌呤、嘧啶、辅酶A以及氧化还原剂如抗坏血酸、谷胱甘肽等，培养293细胞需补充丙酮酸钠 无菌操作要求 手指不能触及器材使用端，如触及需更换或烧灼后再使用（如瓶口）。 减少手与器材的接触面积，学会手指操作。 一切操作，如打开或封闭瓶口、安装吸管、注射器等，都要在火焰周围进行，瓶口、吸管、注射器等要经过火焰消毒。 瓶口要顺风斜放在支架上。试剂使用后应立即封闭瓶口，若长时间敞口，会增加落菌的机会。 细胞培养各用液要专管专用，并要勤换吸管，防止扩大污染和交叉污染。 瓶口液滴不能再进入瓶内，要用干酒精棉球擦拭，瓶口要经火焰消毒。 操作者动作要准确敏捷，尽量避免空气流动。不能面向超净台讲话。 实验中的操作要求： 洗手。双手用肥皂洗净，并用75%酒精擦拭。 细胞培养用液从冰箱中取出，试剂瓶外壁经酒精纱布擦洗后入台。 废液缸置工作台右后位，酒精灯置中间，细胞培养用液置左侧。并注意保持较远距离。 点燃酒精灯。 金属器械、玻璃吸管、培养瓶口等可迅速从火焰上通过，但不能在火焰中烧灼过长时间，冷却后使用。用于吸取细胞培养液、牛血清、酶液的吸管使用后不能在火焰上消毒。 手指污染时，可用酒精棉球或纱布擦拭。 培养基、血清等滴落超净台面时，应立即用酒精棉球或纱布擦拭。 实验过程中，不要面向操作野讲话或咳嗽，避免唾沫将微生物带入超净台内，污染空气。 操作时不要跨越无菌区。 实验后要求： 未使用器材收置归拢，置洁净区域存放。 培养基、血清、PBS等封口，放冰箱中保存。 用过的器材清洗浸泡。 关闭超净台风机和电源，酒精纱布擦拭工作台面。 细胞传代培养技术 细胞换液 细胞传代 换液时机的选择。 培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，营养液酸化变黄，pH值下降，营养液pH值升高，颜色变紫红色。 细胞状态 换液：全量换液和半量换液 细胞传代培养 ：细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 材料： 无菌磷酸生理缓冲液PBS、胰酶、新鲜培养基、 无菌吸管/离心管/培养瓶  *