伪狂犬病毒PCR诊断.ppt

实验目的： 1、了解PCR反应的原理、方法及操作步骤； 2、掌握伪狂犬病毒PCR检测的方法； 什么是PCR？ 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 PCR及有关技术的发展历史（1） 1983 Cetus 公司的 K. Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。 1985 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表 (R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlich and N. Arnheim) PCR及有关技术的发展历史（2） 1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准。 成立于1985年底的Perkin-Elmer Cetus仪器公司 （ PECI ）于这一年的11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪。 1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。 PCR及有关技术的发展历史（3） 1992 年3月Cetus 公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利； Kary Mullis 因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。 PCR及有关技术的发展历史（4） 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测 1999年 西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查 PCR原理 PCR是一种选择性扩增DNA或RNA的方法， 其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。高温变性，低温退火，适温延伸等３步反应循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。 PCR原理 PCR技术在模板DNA、dNTP、Mg2+、合适Buffer等条件下，用耐热的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步骤的反复循环 （25?30次）过程，使目的DNA呈指数扩增 。 （1）DNA模板的热变性 将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。 （2）模板与引物的结合（退火或复性） 将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。 （3）引物延伸 将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸， 形成两条与模板互补的新链。 以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸） （新合成的链可作为下一轮循环的模板） 按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循环 ，PCR产物呈指数扩增。 模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。 PCR product 标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul 2. PCR各要素及其作用 （1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102?105个拷贝； RNA作为模板时，需要： RNA cDNAPCR, 称此为RT-PCR. （2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95℃稳定30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→ 52℃退火→72℃延伸]循环30次过程中不变性失活。 酶及其浓度 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基