分子生物学诊断技术　.ppt

第三节 分子生物学诊断技术;一、DNA探针(DNA probe) 技术;1.基本原理; DNA探针是带有标记物的 已知序列的DNA片段。DNA探针技术的基本原理是碱基 配对。在变性而成为单链的 被检DNA中加入变性的探针，随着温度的降低，探针便可 与被检DNA中的互补序列形 成双链，这一过程称杂交。;通过捕捉探针标记物释放出 的信号，便可知被检DNA中有无与探针序列相同的DNA每一种病原体都具有独特的DNA片段，通过分离和标记这些片段，就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究;2.DNA探针的种类;按DNA探针的来源可分为 cDNA探针和基因组DNA 探针和动基体DNA(kDNA) 三大类; cDNA 探针 是将病原的mRNA反转录为DNA后获得的。其检测 的对象往往是在生命活动 中可以被激活并进行表达 的基因DNA; 基因组DNA探针 来源于基因组。在寄生虫上常用基因组重复序列作为探针。这些重组序列在基因中高度重复，拷贝数很多，便于检出。但这些重复序列并不一定表达; kDNA探针 是较特殊的一类。在动 基体目原生动物中存在动 基体，内含大量环状DNA，分大环和小环两种。其中 小环拷贝数占绝对多数。 故往往以克隆的小环或小 环片段做为探针; 近年来，人们往往根据已知的序列，人工合成寡聚DNA片段做为DNA探针;3.DNA探针的标记物及标记;用于DNA探针标记的有效 射性同位素和非放射性标 记物 常用的放射性同位素有 32P、35S、14C、125I 等;非放射性标记法可将生物 素、地高辛连接在dNTP 上，然后象放射性标记一 样掺入到核酸链中制备标 记探针;4.DNA杂交;杂交技术有固相杂交和液相 杂交之分。固相杂交技术目 前较为常用，先将待测核酸 结合到一定的固相支持物上， 再与液相中的标记探针进行 杂交。固相支持物常用硝酸 纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)或尼 龙膜(nylon membrane);固相杂交包括膜上印迹杂 交和原位杂交。前者包括 三个基本过程：第一，通 过印迹技术将核酸片段转 移到固相支持物上；第二， 用标记探针与支持物上的 核酸片段进行杂交；第三， 杂交信号的检测;用探针对细胞或组织 切片中的核酸杂交并 进行检测的方法称之 为核酸原位杂交。;其特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内，以确定有无该病原体的感染。;原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义; 杂交的第一步是将DNA 或RNA转移到膜上; 斑点印迹(dot—blot) 将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80℃真空烘烤2h; 应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，操作简便、快速，在临床诊断中应用较广，适合进行特定基因的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因的分子量; Southern印迹(southern blot) 是指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程; 常规处理如下，先用限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理，经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行变性处理，使双链DNA解离成单链，并将其转移到NC膜或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。;Southern印迹的方法有3种，分别为毛细管转移(或虹吸印迹)，电转移 和真空印迹，详细操作可参阅有关书籍; Southern印迹后的滤膜仍需进行固定处理，对NC膜可用80℃真空烘烤2h，对尼龙膜还可用短波紫外线(波长254nm)照射几分钟; Northern印迹(Northern blot) 是指将RNA片段变性及电 泳分离后，转移到固相支持 物上的过程。RNA的变性方 法与DNA不同，RNA不能用碱变性，因为碱会导致RNA 水解。;因此，在Northern印迹前，须进行RNA变性电泳，在电泳过程中使RNA解离形成单链分布在凝胶上，再进行印迹转移。转移方法与DNA相似; RNA变性电泳的原理，是用一定剂量的乙二醛—二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢氧化汞等处理RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过程中变性而完全解离形成单链; 第二步为杂交反应。杂交反应包